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1. Marcatura fluorescente e perfusione di leucociti (PMN o THP-1 per monociti umani e RAW264.7 o primari di topo per il test basato sul flusso murino)
- Etichettatura fluorescente
- Etichettare i leucociti (1 x 106/mL) con la colorazione fluorescente dell'acido nucleico verde permeabile alle cellule (1 μM). Incubare le cellule per 30 minuti a 37 °C.
- Lavare le cellule con PBS mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti e sospendere le cellule a una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL (5 mL per condizione di test, a seconda della velocità di flusso) in un tampone di saggio.
- Preparazione del saggio della camera di flusso
- Per l'adesione dei leucociti su un monostrato cellulare, scartare il terreno di coltura cellulare dalla piastra e assemblarlo nella camera di flusso. Collegare il tubo alla siringa. Per l'adesione dei leucociti sulle piastrine immobilizzate, collegare il micro vetrino alla siringa. Preriscaldare un bagnomaria a 37 °C.
- Prendere una siringa da perfusione (50 ml), installare la siringa sul supporto della siringa e impostare la pompa in modalità di estrazione. Impostare il volume della pompa su 0 mL e impostare il diametro su 26,70 mm per la siringa da 50 mL.
- Collegare un connettore luer a gomito a un'estremità del tubo. Posizionare un accoppiatore luer lock sulla siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito all'accoppiatore luer lock. Collegare l'estremità del tubo libero alla camera di flusso.
- Perfusione e adesione leucocitaria
- Per l'adesione dei leucociti su un monostrato cellulare, scartare il terreno di coltura cellulare dalla piastra e assemblarlo nella camera di flusso. Collegare il tubo alla siringa. Per l'adesione dei leucociti sulle piastrine immobilizzate, collegare il micro vetrino alla siringa.
- Per la perfusione e l'adesione dei leucociti su un monostrato vascolare o piastrinico, posizionare il secondo tubo in un tubo conico da 50 ml contenente tampone per saggio e riempire il tubo con una pipetta da 1 ml, quindi spremere il tubo e collegarlo a una camera di flusso.
- Prima della perfusione leucocitaria, aggiungere 3 mM di CaCl2 e 2 mM di MgCl2 alla sospensione cellulare e incubare per 5 minuti a 37 °C.
- Perfondere il tampone di saggio prima della perfusione delle cellule per rimuovere l'eventuale aria dalla camera e dal tubo.
- Chiudere le estremità delle provette stringendole saldamente e commutando il tubo dal tampone di analisi alla sospensione cellulare, evitando che le bolle d'aria rimangano intrappolate. Perfondere le celle con un'adeguata velocità di flusso/sforzo di taglio fino all'arrivo delle prime cellule.
- Perfondere le cellule con un'adeguata velocità di flusso/sforzo di taglio per 2 minuti e acquisire almeno 6 immagini tra 2-6 minuti di cellule rotanti e aderenti con un microscopio a contrasto di fase/fluorescenza invertita (ad es. EVOS-FL) utilizzando un ingrandimento 100X collegato a una telecamera CCD digitale o CMOS.
NOTA: La portata/sforzo di taglio dipende dalle dimensioni della camera di flusso e dalla viscosità del perfusato. Per la camera di perfusione qui utilizzata (vedi Tabella dei materiali):
τ=η*97.1*Φ
τ: sforzo di taglio (1 dyn/cm2)
η: viscosità (0,015 dyn*s/cm2)
Φ: Portata (0,67 mL/min)
- Deadesione leucocitaria
- Per la deadesione, commutare il tubo dalla sospensione cellulare al tampone di saggio comprimendo il tubo, evitando che le bolle d'aria rimangano intrappolate.
- Staccare le cellule per perfusione con un tampone di saggio con una velocità di flusso/sforzo di taglio appropriato (vedere la nota 3.3.7).
- Trasmigrazione leucocitaria
- Per la trasmigrazione leucocitaria, perfondere i leucociti (passaggio 3) fino a quando non aderisce una quantità adeguata di leucociti (~50 cellule/campo visivo).
- Sostituire la sospensione leucocitaria con un tampone per il test.
- Registrare le cellule trasmigrate mediante time-lapse ogni 10-15 s per 30-60 minuti a 37 °C.