$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fabbricazione di nanostrutture
- Scegli vetrini coprioggetti in vetro di 25 mm di diametro con uno spessore approssimativo di 170 μm (n. 1,5) come substrati per la nanofabbricazione.
- Immergere i vetrini coprioggetti in una soluzione di piranha (rapporto 3:1 di acido solforico e perossido di idrogeno) per almeno 6 ore. Lavare il vetrino coprioggetti imbevuto di piranha con abbondanti quantità di acqua distillata deionizzata ultrapura da 18,2 MΩ (DDW).
cautela: L'acido piranha reagisce violentemente con i materiali organici e deve essere maneggiato con estrema cura.
- Depositare un film sottile di cromo da 10 nm sui vetrini coprioggetti mediante evaporazione a fascio elettronico per evitare effetti di carica durante il patterning e l'imaging delle nanostrutture.
- Centrifugare il primo strato di resist a doppio strato costituito da copolimero di lattato di etile metacrilato di metile (MMA_EL6) a 2.000 giri/min per 45 secondi, quindi cuocere a 150 °C. Centrifugare il secondo strato di polimetilmetacrilato (950PMMA_A2) a 3.000 giri/min per 45 secondi, quindi cuocere a 180 °C.
- Modellare il doppio strato di resist utilizzando la litografia a fascio di elettroni (EBL) a 25 kV con una dose di area di 300 μC/cm2. Sviluppare in alcool isopropilico (IPA)/metil isobutililchetone (MIBK): 2/1 e risciacquare con IPA.
- Depositare il film Ti (5 nm) / Au (80 nm) sul substrato utilizzando un evaporatore e-beam.
- Dopo la deposizione dell'oro, sollevare il doppio strato di copolimero resist immergendo il substrato in acetone per 4 ore.
- Ispezionare il substrato utilizzando il microscopio elettronico a scansione (SEM) per confermare la forma e le dimensioni della nanostruttura, rimuovere il cromo rimanente dal substrato tramite incisione a umido utilizzando il mordenzante CR-7 per 60 secondi a RT, quindi risciacquare in DDW.
- Progetta una spaziatura da centro a centro dell'array di 33 μm per lasciare spazio all'imaging cellulare tra gli array. Modellare le nanostrutture in un modello 20 x 20 per ogni array con un passo di 300 nm utilizzando un e-beam writer. Ogni chip contiene 300 array con una dimensione tipica della nanostruttura di 80±2,5 nm di altezza e 70±2,5 nm di diametro.
- Ispezionare un sottoinsieme di array utilizzando il microscopio a forza atomica (AFM) per la verifica delle dimensioni e dell'uniformità.
- Fissare un anello di supporto, tipicamente in silicone, sul retro del vetrino coprioggetti utilizzando una resina epossidica a polimerizzazione UV.
2. Pulizia dei trucioli e applicazione del monostrato autoassemblato
- Per la pulizia e la rigenerazione dei trucioli, cenere al plasma ad una potenza di 40 W in una miscela da 300 mTorr di idrogeno al 5% e argon al 95% per 45 sec dopo aver pulito la camera per 5 min nelle stesse condizioni.
- Funzionalizzare le nanostrutture d'oro immediatamente dopo l'incenerimento al plasma immergendo il chip in una soluzione di tiolo etanolico a due componenti costituita da un rapporto 3:1 di SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) e un componente con un gruppo funzionale amminico o carbossilico, vale a dire, SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) o SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Lasciare il chip nella soluzione tiolica O/N per formare un monostrato autoassemblato (SAM).
- Sciacquare il chip con etanolo e asciugarlo con azoto gassoso.
- Se necessario, conservare il chip funzionalizzato per un massimo di 2 settimane a 4 °C.
- Quando è pronto per l'uso, far reagire il componente SPN o SPC con il ligando utilizzando una chimica che dipende dal ligando scelto (vedi sotto).
nota: I chip possono essere rigenerati e rifunzionalizzati decine di volte. Un determinato chip può essere utilizzato per periodi che vanno da 6 mesi a oltre un anno. Gli spettri misurati su un dato array vengono riprodotti in modo affidabile dopo ripetute rigenerazioni mediante incenerimento al plasma, seguite da biofunzionalizzazione.
3. Funzionalizzazione delle superfici e caratterizzazione cinetica
Nota: Utilizzare il chip funzionalizzato nello strumento SPR commerciale per caratterizzare le costanti di velocità cinetica tra il ligando e l'analita, nonché per studiare la resistenza del SAM al legame non specifico. Esiste un'ampia gamma di portate e design microfluidici che consentono un'efficiente funzionalizzazione delle superfici. Poiché disponiamo di un SPR disponibile in commercio, abbiamo standardizzato le portate consigliate. Notiamo che queste portate sono tipiche di tutti gli strumenti SPR e quindi non sono restrittive. Lo strumento SPR non è una necessità poiché tutta la funzionalizzazione può essere eseguita direttamente sul chip di risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR), ma ha ridotto il nostro carico di lavoro perché è uno strumento multiplexato mentre la nostra configurazione microfluidica LSPR non lo è.
- Funzionalizzare un chip d'oro nudo commerciale con il SAM come descritto nella Sezione 2.
- Se si utilizza un SAM basato su SPC, attivare il gruppo carbossilico con una miscela 1:1 di 133 mM di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) e 33 mM di N-idrossisuccinimide (NHS) in DDW per 10 minuti.
- Coniugare il gruppo carbossilico attivato con l'anticorpo/ligando di interesse per 300 secondi utilizzando una velocità di flusso di 30 μl/min. Preparare i ligandi in tampone fosfato a pH 6, in genere, ma questo può variare a seconda della molecola.
- Dopo la coniugazione del ligando, far fluire 0,1 M di etanolammina in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come fase di disattivazione per 300 secondi a una velocità di 30 μl/min. L'etanolammina aiuta a minimizzare il legame non specifico.
- Introdurre l'analita di interesse a una velocità di flusso di 100 μl/min utilizzando un intervallo di concentrazioni e calcolare le costanti di velocità cinetica utilizzando un software di analisi cinetica.
- Se l'associazione non specifica è problematica, aumentare il rapporto tra SPO e SPC o SPN.
4. Impostazioni generali LSPR
- Impostazioni del microscopio:
- Utilizzare una lampada alogena da 100 W per illuminare il campione da Koehler. Utilizzare un filtro passa-lungo (in genere taglio a 593 nm) nel percorso della luce per eliminare le lunghezze d'onda che non contribuiscono allo spostamento della risonanza (Figura 1).
- Per la raccolta dei dati LSPRi, utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo a immersione in olio 40X (1,4 NA) e una telecamera CCD a 16 bit raffreddata termoelettricamente.
- Posizionare un divisore di fascio sulla porta di uscita del microscopio per ottenere immagini e spettri contemporaneamente.
- Impostare il tavolino del microscopio a temperatura controllata a 37 °C ed equilibrare per 4 ore.
- Incorporare un gruppo di incubazione aggiuntivo sul microscopio per regolare la concentrazione di CO2 e l'umidità rispettivamente al 5% e al 95%.
- Preparazione e montaggio del truciolo:
- Funzionalizzare il chip LSPR come descritto nella Sezione 2 con i rapporti SAM ottimali a due-8 componenti determinati dagli esperimenti SPR.
- Caricare il chip all'interno di un supporto microfluidico su misura come segue. Posiziona il chip su un pezzo inferiore di alluminio. Inserire il chip tra questo pezzo inferiore e una guarnizione in silicone e un pezzo superiore in plastica trasparente. Utilizzare 4 viti per bloccare il gruppo.
- Per una tipica applicazione di tioli a base di SPC, applicare 300 μl di una miscela 1:1 di 133 mM di EDC e 33 mM di NHS in DDW per attivare i gruppi carbossilici del componente tiolico SPC.
- Attendere 10 minuti e risciacquare manualmente la superficie con 10 mM PBS.
- Coniugare il gruppo carbossilico attivato con il ligando (tipicamente un anticorpo o un frammento di anticorpo) di interesse rivestendo con gocce 300 μl di soluzione di ligando.
- Attendere 30 minuti e risciacquare manualmente con 10 mM PBS.
- Applicare 300 μl di etanolammina 0,1 M in PBS sul chip per ridurre al minimo il legame aspecifico. Attendere 10 minuti.
- Lavare l'etanolammina con PBS contenente lo 0,005% di Tween 20 (PBS-T20).
- Posiziona un pezzo di quarzo sopra il chip per ridurre le fluttuazioni nei dati relativi a un menisco variabile.
- Mantenere il chip bagnato con il tampone PBS-T20 durante il montaggio sul microscopio.
- Posizionare saldamente il gruppo chip LSPR nel portacampioni riscaldato e collegare il tubo microfluidico.
- Collegare il tubo microfluidico al gruppo e al tampone di flusso (o terreno privo di siero per studi cellulari) fino a raggiungere uno stato stazionario.
- Lasciare che il gruppo e il microscopio si equilibrino per almeno 2 ore.
- Allineare il chip utilizzando un joystick in modo che l'array centrale sia allineato con la fibra ottica per la spettroscopia. I dati spettroscopici vengono acquisiti utilizzando uno spettrometro e un software di analisi spettrale.
- Mantieni le matrici a fuoco durante l'esperimento utilizzando l'autofocus software, Zeiss Definite Focus o un dispositivo di messa a fuoco automatica equivalente.
5. Imaging LSPR delle secrezioni anti-c-myc da cellule di ibridoma 9E10
Nota: la linea cellulare di ibridoma utilizzata per questo studio esprime costitutivamente anticorpi anti-c-myc e quindi non richiede un innesco chimico
- Funzionalizzare le nanostrutture con il peptide c-myc. Questo ha un valore KD di 1,77 nM per gli anticorpi anti-c-myc secreti dalle cellule di ibridoma clone 9E10.
- Coltura delle cellule di ibridoma in un terreno di crescita completo con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico in un pallone T75 a 37 °C sotto il 5% di CO2. Mantenere una densità cellulare di 4 ×105 cellule/ml.
- Per gli studi sulla secrezione cellulare, le cellule in pellet dal pallone T75 mediante centrifugazione, lavare due volte con terreno privo di siero (SFM) RPMI-1640 per rimuovere gli anticorpi secreti e regolare la densità cellulare a 4 ×106 cellule/ml.
- Raccogli le cellule e testane la vitalità prima di introdurle sui chip LSPR.
- Introdurre manualmente 50 μl della soluzione cellulare sui chip LSPR con una micropipetta. Dopo alcuni minuti, da 25 a 50 celle aderiscono alla superficie dei chip LSPR.
- Lavare via le cellule rimanenti in soluzione con SFM fresco utilizzando il sistema di perfusione microfluidica.
- Selezionare gli array LSPR per l'imaging che sono vicini, entro 10 μm, ma non sovrapposti alle celle.
- Per garantire che il segnale sia specifico per gli anticorpi anti-c-myc secreti, introdurre i terreni di coltura cellulare con e senza gli anticorpi presenti, nonché con gli anticorpi, ma con i loro siti di legame bloccati dalla presenza di una concentrazione saturante di peptide c-myc nella soluzione.
- Calibrare i sensori al termine di ogni seduta con una soluzione saturante di anticorpi anti-c-myc (250 nM). Questo aiuta a normalizzare la risposta dei sensori e a determinare l'occupazione frazionaria in base al profilo di biofunzionalizzazione di ogni corsa.
- Correggere la deriva nelle direzioni X e Y utilizzando il software di allineamento dell'immagine.
