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1. Titolazione del virus
NOTA: A seconda del numero di virus e del numero di duplicati, è possibile allestire una piastra a pozzetti con le seguenti flessibilità: (1) La diluizione virale può essere disposta lungo le righe o le colonne (Figura 1). Ogni virus dovrebbe occupare una riga/colonna separata. (2) L'incremento della diluizione virale è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la concentrazione virale più alta nell'angolo in alto a sinistra. (3) Non vi è alcuna restrizione sul numero di duplicati.
- Aliquotare un numero sufficiente di cellule MDCK o di cellule MDCK-SIAT8 in piastre a 96 pozzetti (200 μl/pozzetto). Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% per 2 o 3 giorni fino a raggiungere la confluenza. Propagare le cellule in DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS) e antibiotici (100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina). Incubare le cellule SIAT a 37 °C con CO2 al 5% e 1 mg/ml di G418 solfato.
nota: Il fattore di diluizione dipende dall'esperienza e dalla linea cellulare utilizzata. Al momento dell'inoculazione del virus, il monostrato cellulare deve essere confluente (cioè senza parete cellulare o contorno visibile per le cellule MDCK e un layout strettamente impacchettato per le cellule MDCK-SIAT1). Esempi di diluizioni basate sulla sottocoltura di fiasche confluenti di cellule MDCK o MDCK-SIAT1 sono riportati nella Tabella 1.
- Lavare le cellule 3 volte con 200 μl di terreno di crescita virale (VGM) per pozzetto. Sterilizzare la lavapiatti a parete multipla con il 70% di EtOH per 30 minuti, quindi sciacquarla con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) o VGM prima del lavaggio.
- Aspirare il VGM e aggiungere immediatamente 50 μl di VGM a ciascun pozzetto.
- Aggiungere 900 μl di VGM a ciascuna delle 6 provette sterili (o meno, a seconda del numero di virus in esame e duplicati). Pipettare 100 μl di virus nella prima provetta, mescolare bene e diluire in serie, cambiando i puntali tra una diluizione e l'altra. Ripetere l'operazione per ogni virus da titolare.
nota: Questo darà diluizioni del virus da 10-1 a 10-6.
- Aggiungere 50 μl di ciascuna diluizione del virus, iniziando dalla diluizione più alta (1 x 10-5 nella Figura 1), ai pozzetti duplicati (colonne 9 e 10 nella Figura 1) di una piastra a 96 pozzetti.
- Posizionare la piastra a 37 °C per 2-3 ore per consentire al virus di infettare le cellule.
nota: È necessaria un'incubazione di 2 o 3 ore per garantire che i virus nell'inoculo abbiano abbastanza tempo per raggiungere il monostrato.
- Preparare la sovrapposizione (10 ml/piastra)
nota: L'overlay è composto da 5 ml di 2x DMEM, tripsina (concentrazione finale di 2 μg/ml), 20 μl di stock da 1 mg/ml e 5 ml di linters di cotone cellulosico (vedere l'elenco dei materiali).
- Rimuovere l'inoculo.
- Aggiungere l'overlay (200 μl in ogni pozzetto). Incubare per una notte a 37 °C, INDISTURBATO.
nota: La gemmazione del virus avviene dopo circa 4 ore, quindi è importante che la placca non venga disturbata dopo questo tempo.
- Aspirare il rivestimento dai pozzetti.
- Aggiungere paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS A (200 μl/pozzetto). Metterli a 4 °C per 30 min o a temperatura ambiente per 20 min.
NOTA: PBS A è una soluzione salina tamponata con fosfato a pH naturale con 10 g di NaCl, 0,25 g di KCl, 1,437 g di Na2HPO4, 0,25 g di KH2PO4 e 1 L di acqua distillata (vedere l'elenco dei materiali).
NOTA: La paraformaldeide è dannosa se inalata e può causare ustioni se ingerita. Ci sono anche prove limitate di un effetto cancerogeno e può causare sensibilizzazione dopo il contatto con la pelle.
- Aspirare la paraformaldeide e lavare due volte le piastre con PBS A (200 μl/pozzetto).
- Conservare le piastre in PBS A a 4 °C per un uso futuro o continuare con i passaggi seguenti.
- Aggiungere un tampone di permeabilizzazione (100 μl/pozzetto). Lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare la piastra due volte con PBS A (200 μl/pozzetto).
- Aggiungere 50 μl del primo anticorpo, MAb di topo contro l'influenza di tipo A (1:1.000 in tampone ELISA), per pozzetto. Incubarlo a temperatura ambiente per 1 ora (o 4 °C durante la notte), agitandolo.
- Lavarlo 3 volte in 100 μl di tampone di lavaggio (0,05% Tween 80 in PBS A, v/v) per pozzetto. Incubarlo a temperatura ambiente per 5 minuti tra un lavaggio e l'altro. In alternativa, lavarlo 3 volte senza incubazione utilizzando 300 μl per pozzetto.
- Aggiungere 50 μl del secondo anticorpo, coniugato HRP IgG (H+L) di capra e anti-topo (1:1.000 in tampone ELISA), per pozzetto. Incubarlo a temperatura ambiente per 1 ora, agitandolo.
- Lavarlo 3 volte come descritto al punto 1.17.
- Aggiungere il substrato (50 μl/pozzetto). Incubarlo a temperatura ambiente per 30 minuti o fino a quando lo sviluppo di un colore blu è chiaramente visibile.
- Per fermare la reazione, lavare la piastra due volte con 200 μl di acqua distillata per pozzetto, incubando a temperatura ambiente per 2-3 minuti tra i lavaggi.
- Asciugare la piastra all'aria e conservarla in un luogo buio (ad esempio, avvolgerla in un foglio di alluminio).
2. Neutralizzazione del virus
NOTA: Calcola il numero di piastre necessarie per il test di neutralizzazione. Ogni piastra può contenere un virus e un numero di antisieri.
NOTA: A seconda del numero di antisieri e del numero di duplicati, è possibile allestire una piastra a pozzetti con le seguenti flessibilità: (1) La diluizione del siero può essere disposta lungo una riga o una colonna (Figura 2). Ogni siero dovrebbe occupare una riga o una colonna separata. (2) L'incremento della diluizione del siero è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la massima concentrazione sierica nell'angolo in alto a sinistra di una piastra. (3) Il numero di duplicati bilancia il numero di antisieri. Più duplicati possono aiutare a smussare le variazioni sperimentali. (4) Il numero dei duplicati VC e il numero dei duplicati del controllo cella (CC) sono flessibili, ma devono anche essere in righe o colonne separate. Ci si aspetta che il numero di duplicati VC sia significativamente maggiore di quello degli antisieri.
- Preparare il monostrato cellulare, come nei passaggi 1.1-1.3, 2 o 3 giorni prima.
- Aggiungere 50 μl di VGM in ciascun pozzetto della piastra.
- Utilizzare le colonne 11 e 12 rispettivamente per VC e CC. Aggiungere 50 μl di aliquote di siero trattato con enzimi che distruggono il recettore (RDE) 1:20 alla prima riga (A) delle colonne 1-10.
nota: Per ogni combinazione di virus e siero, il test viene eseguito in duplicato, quindi una piastra può, ad esempio, contenere un virus testato contro cinque antisieri.
- Eseguire diluizioni seriali 2 volte trasferendo 50 μl dalla riga A alla riga H (colonne 1-10 nella Figura 2) e scartando 50 μl dalla riga H.
- Aggiungere 50 μl di diluente a ciascun pozzetto della colonna CC (colonna 12 nella Figura 2).
- Aggiungere 50 μl di virus a ciascun pozzetto della piastra, ad eccezione della colonna CC (colonne 1-11, righe A-H nella Figura 2).
- Incubarlo a 37 °C per 2-3 ore. Rimuovere l'inoculo. Aggiungere il rivestimento (200 μl) a ciascun pozzetto. Incubarlo per una notte a 37 °C, INDISTURBATO. Fissare e colorare le piastre come per la titolazione del virus (passaggi 1.11-1.22).
3. Quantificazione della neutralizzazione
- Posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner piano, come mostrato nella Figura 2a. Utilizzare il limite di posizione a forma di L per garantire una posizione di imaging ottimale e ripetibile.
nota: È possibile visualizzare due piastre a pozzetti in un'unica scansione.
- Scansiona la lastra.
- Eseguire il software "Wellplate Reader" per calcolare i titoli virali richiesti (Figura 3).
- Fare clic sul pulsante "Carica immagine" per caricare un'immagine. Far scorrere la barra rossa in "Soglia globale" per regolare la soglia di campionamento. Fare clic sul pulsante "Aggiorna" per esaminare l'effetto.
- Selezionare la casella "Calcola neutralizzazione/titolazione". Fare clic sul pulsante "Campionamento" per quantificare l'ICP. Fare clic sul pulsante "Salva" per salvare i risultati del campionamento quando richiesto.
nota: Dopo il processo di campionamento, se la casella "Calcola neutralizzazione/titolazione" viene visualizzata automaticamente una nuova finestra chiamata "Calcolo neutralizzazione/titolazione".
- Caricare o inserire la mappa della piastra a pozzetti. Indicare la soglia (ad esempio, 50%) in "Neutralizzazione: deduzione dell'infezione (%)".
- Seleziona "Processo di neutralizzazione" per calcolare i titoli. Controlla i titoli e fai clic sul pulsante "Salva e chiudi" per salvare i risultati della neutralizzazione.
nota: La neutralizzazione è riportata come il reciproco della massima diluizione del siero con la riduzione predefinita dell'ICP (ad esempio del 50% o dell'80%) rispetto al VC (la media della colonna 11 nella Figura 4). Nei risultati rappresentativi è stata utilizzata una riduzione del 50% dell'ICP.
