Quantificazione dell'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero

Abstract

Fonte: Luhr, M. et al., Il saggio di sequestro della lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero. (2018)

Il video mostra un test per valutare l'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero. Utilizza l'elettroporazione per rilasciare proteine citosoliche, tra cui la lattato deidrogenasi (LDH). Le frazioni di LDH sequestrate e LDH cellulari totali sono determinate per valutare il sequestro di LDH, fornendo informazioni sull'attività complessiva di sequestro di massa.

Protocollo

1. Semina e trattamento cellulare

1. Coltura di cellule aderenti in fiasche di coltura tissutale da 75 cm² in un incubatore umidificato con CO₂ al 5% a 37 °C, utilizzando il terreno di coltura preferito per il tipo di cellula in questione. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere uno strato cellulare quasi confluente.
   nota: Utilizzare il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per LNCaP, HEK293, fibroblasti embrionali di topo (MEF), cellule BJ, MCF-7 e RPE-1.
   1. Lavare le cellule con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C, pH 7,4. Sostituire il PBS con 3 mL di tripsin-etilendiamminetraacetato (EDTA) allo 0,25% (p/v) e incubare il matraccio in un incubatore umidificato con CO₂ al 5% a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano (2-5 min).
   2. Risospendere le cellule staccate con un terreno di coltura da 7 mL contenente il 10% di FBS. Miscelare un'aliquota di sospensione cellulare da 10 μl con 10 μl di tripano blu allo 0,4% in una provetta per microcentrifuga, utilizzando un puntale per pipetta da 0,5-20 μl. Utilizzare la stessa punta della pipetta per riempire immediatamente un vetrino della camera di conteggio e contare le cellule in un contatore di cellule automatizzato.
2. Preparare un'adeguata diluizione (vedere la nota seguente) della sospensione cellulare del passaggio 1.1.2 utilizzando un terreno di coltura contenente il 10% di FBS e seminare 1 mL della sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti (area superficiale ~3,8 cm²) utilizzando una tecnica asettica. Lasciare crescere in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ a 37 °C fino a raggiungere la densità cellulare desiderata, ad esempio una confluenza del 60-90% al momento del raccolto.
   nota: L'appropriata diluizione della sospensione cellulare che darà la confluenza cellulare desiderata al momento del prelievo varierà da tipo di cellula a tipo di cellula, nonché in base alla durata e al tipo di trattamenti sperimentali. Pertanto, questo deve essere valutato empiricamente in ogni caso.
   1. Per gli esperimenti che devono essere trattati e raccolti 2 giorni dopo la semina, seminare 2,5 x 10⁵ cellule LNCaP, HEK293 o MCF-7, 5 x 10⁴ MEF, 4 x 10⁵ BJ o 1,5 x 10⁵ cellule RPE-1 in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
   2. Per le celle che aderiscono liberamente, rivestire le piastre con il tipo di rivestimento consigliato per il tipo di cella in questione. Per le celle LNCaP (e HEK293) utilizzare piastre rivestite con poli-D-lisina (PDL).
   3. A tal fine, aggiungere 500 μL di PDL a 2,5 μg/mL in H₂O sterile in ciascun pozzetto e incubare le piastre in un ambiente sterile per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 °C). Rimuovere il PDL con aspirazione e lavare brevemente ogni pozzetto con 1 mL di H₂O. sterile
      nota: Generalmente, la fase 1.2.1 viene eseguita senza alcun trattamento sperimentale. Tuttavia, se si esegue l'RNAi, può essere conveniente avviare una trasfezione inversa con la semina.
3. Eseguire trattamenti sperimentali in pozzetti duplicati o triplicati per condizione.
   1. Ad esempio, trattare le cellule con 50 nM di torin1, inibitore di mTOR, che generalmente è un efficiente induttore del sequestro autofagico, o sottoporre le cellule a una carenza acuta di siero e aminoacidi lavando le cellule con 1 mL di terreno privo di aminoacidi Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) e successivamente incubare le cellule in 1 mL di EBSS in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica (CO₂) a 37 °C.
   2. Lasciare una serie di pozzetti non trattati per definire i livelli di fondo di lattato deidrogenasi sedimentabile (LDH).
   3. Aggiungere una quantità saturante dell'inibitore post-sequestro bafilomicina A1 (Baf) in assenza o presenza dei trattamenti sperimentali, 3-4 ore prima del prelievo cellulare. Incubare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ a 37 °C.
      1. Utilizzare 100 nM Baf per le celle LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e RPE-1 e 10 nM Baf per le MEF.
      2. Per i trattamenti sperimentali che hanno una durata di sole 3-4 ore (come quelli esemplificati nella fase 1.3.1), aggiungere Baf contemporaneamente ai trattamenti. Per trattamenti sperimentali più lunghi, attendere fino a 3-4 ore prima del raccolto e aggiungere 2 μL di un brodo Baf concentrato 500x direttamente nel terreno.
      3. Mescolare agitando la piastra subito dopo l'aggiunta di Baf. A questo punto, si raccomanda anche di aggiungere inibitori del sequestro macroautofagico come controlli, ad esempio 10 mM dell'inibitore della pan-fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) 3-metil adenina (3MA) o 10 μM dell'inibitore selettivo PI3K di classe III SAR-405.

2. Raccolta delle celle e preparazione per l'elettrodistruzione

1. Al termine del periodo di trattamento, aspirare il terreno con aspirazione e aggiungere 200 μl di soluzione di distacco cellulare (preriscaldata a 37 °C) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C fino al distacco delle cellule (in genere circa 5 minuti).
   nota: Mentre lo 0,25% (p/v) di tripsina-EDTA può essere utilizzato al posto della soluzione di distacco cellulare, quest'ultima contiene DNasi, che aiuta a ridurre la viscosità delle cellule staccate. Finché il terreno è completamente aspirato, non è necessario lavare le cellule prima dell'aggiunta di tripsina-EDTA o della soluzione di distacco cellulare.
2. Aggiungere 500 μL di PBS a temperatura ambiente (20-25 °C), pH 7,4, contenente il 2% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) in ciascun pozzetto e risospendere con la pipetta fino a quando non sono visibili grumi cellulari. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 mL con ghiaccio.
   nota: Salvo diversa indicazione, eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio.
3. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
4. Aspirare accuratamente il surnatante (con aspirazione) per lasciare i pellet cellulari il più asciutti possibile.
5. Aggiungere 400 μl di saccarosio al 10% (p/v) (in H₂O ultrapuro) a ciascuna provetta.

3. Elettrodisgregazione della membrana plasmatica e separazione di frazioni di cellule sedimentabili e totali

1. Risospendere il pellet di cella con una pipetta per ottenere una sospensione quasi singola e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione da 4 mm.
   nota: Di solito è sufficiente pipettare su e giù ~10-15 volte, utilizzando un puntale per pipetta da 100-1.000 μl.
2. Posizionare la cuvetta in un elettroporatore a onda di decadimento esponenziale e scaricare un singolo impulso elettrico a 800 V, 25 μF e 400 Ω; queste impostazioni producono un impulso della durata di ~8 ms.
3. Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per trasferire il disgregatore cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 400 μl di soluzione di saccarosio tamponata con fosfato ghiacciato (100 mM di monofosfato di sodio, 2 mM di ditiotreitolo (DTT), 2 mM di EDTA e saccarosio all'1,75%, pH 7,5) e mescolare brevemente mediante pipettaggio.
   1. Opzionale: per verificare l'efficienza dell'elettrodisgregazione della membrana plasmatica, mescolare 10 μl di disgregatore cellulare diluito dalla fase 3.3 con 10 μl di tripano blu allo 0,4% in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire in una camera di conteggio e verificare che la percentuale di cellule positive al Blu di Tripano sia del >99%.
      1. Lasciare il campione nella camera di conteggio per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 °C) e verificare che la percentuale di cellule positive al Trypan Blue sia rimasta >99%.
   2. Facoltativo: per verificare che l'elettrodisgregazione non sia stata troppo violenta, cioè che non abbia interrotto gli organelli intracellulari, eseguire i passaggi 1.1-3.3 come descritto sopra, ma utilizzare un materiale di partenza più grande (un pozzetto da una piastra a 6 pozzetti con uno strato di celle confluenti di ~80%) e utilizzare 150 μL di saccarosio al 10% nel passaggio 2.5 e 150 μL di soluzione di saccarosio tamponata con fosfato senza DTT nel passaggio 3.3.
      1. Utilizzare una pipetta per sovrapporre accuratamente 200 μL della soluzione di disgregazione cellulare diluita sopra un cuscino di densità da 1,2 mL di terreno a gradiente di densità all'8% (p/v) tamponato con fosfato (ad es. Nycodenz all'8%, 50 mM di fosfato di sodio, 2,2% di saccarosio, 1 mM di EDTA) in una provetta da centrifuga da 2 mL. Centrifugare a 20.000 x g per 45 minuti a 4 °C in una microcentrifuga con funzione soft-mode (per un'accelerazione e una decelerazione delicate) e mettere accuratamente le provette sul ghiaccio.
      2. Rimuovere con cautela 60 μl della frazione superiore di ~200 μl, facendo attenzione a non prelevare alcuna soluzione di terreno a gradiente di densità, e trasferire in una nuova provetta per microcentrifuga.
         nota: Questo dovrebbe contenere citosol di eccezionale purezza, chiamato "linfa cellulare".
      3. Testare la purezza della frazione ottenuta nella fase precedente, eseguendo analisi western blot di proteine contenute negli organelli, utilizzando tecniche standard e gel a gradiente al 4-20%.
      4. Eseguire, ad esempio, l'immunoblotting per la catepsina B, il citocromo c e la proteina disolfuro isomerasi, per verificare che la scossa elettrica nel passaggio 3.2 non abbia interrotto lisosomi, mitocondri o reticolo endoplasmatico, rispettivamente, e immunoblot per LDH per verificare la presenza di una proteina citosolica nella linfa cellulare.
      5. Parallelamente, eseguire l'immunoblotting su estratti proteici ricavati dalla soluzione di disgregazione cellulare totale per confermare che gli anticorpi utilizzati siano in grado di rilevare le proteine contenute negli organelli che vengono valutate.
4. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 per ogni campione.
5. Rimuovere 550 μl da ciascuna soluzione di disgregazione cellulare diluita (ottenuta al passaggio 3.3) in provette per microcentrifuga da 2 mL contenenti 900 μl di tampone di risospensione ghiacciato (50 mM di monofosfato di sodio, 1 mM di DTT, 1 mM di EDTA e 5,9% di saccarosio, pH 7,5) integrato con 0,5% di BSA e 0,01% di Tween-20 e mescolare brevemente mediante pipettaggio.
6. Centrifugare a 18.000 x g per 45 min a 4 °C per produrre pellet contenenti "LDH sedimentato". Aspirare accuratamente il surnatante (con aspirazione) per lasciare i pellet il più asciutti possibile. Mettere i campioni in un congelatore a -80 °C.
7. Trasferire 150 μl da ciascuna soluzione di disgregazione cellulare diluita (ottenuta al passaggio 3.3) in nuove provette e porre i campioni in un congelatore a -80 °C. Utilizzare questi campioni per determinare i livelli di "LDH totale" nelle cellule.
   nota: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa per tutto il tempo desiderato.

4. Estrazione di LDH e misurazione dell'attività enzimatica di LDH

1. Scongelare i campioni di "LDH sedimentato" (dal passaggio 3.6) e di "LDH totale" (dal passaggio 3.7) su ghiaccio.
2. Aggiungere 300 μl di tampone di risospensione ghiacciato contenente l'1,5% di Triton X-405 ai campioni di "LDH totale" (ottenendo una concentrazione finale di Triton X-405 dell'1%). Ruotare i campioni su un rullo in una cella frigorifera (4-8 °C) per 30 minuti.
3. Aggiungere 750 μl di tampone di risospensione ghiacciato con Triton X-405 all'1% ai campioni di "LDH sedimentato" e risospendere i pellet con una pipetta fino a raggiungere una soluzione omogenea.
4. Centrifugare i campioni delle fasi 4.2 e 4.3 a 18.000 x g per 5 minuti a 4 °C per sedimentare i detriti cellulari non disciolti.
5. Mescolare 4 parti di imidazolo freddo 65 mM (pH 7,5)/0,75 mM piruvato con una parte di imidazolo freddo 65 mM (pH 7,5)/1,8 mM NADH per ottenere una soluzione di lavoro stabile per almeno tre settimane a 4 °C.
6. Miscelare 3-30 μl dei surnatanti della fase 4.4 con 200 μl della soluzione di lavoro della fase 4.5.
7. Determinare la quantità di LDH misurando l'attività enzimatica dell'LDH come il declino dell'assorbanza della nicotinammide adenina dinucleotide (forma ridotta) (NADH) a 340 nm a 37 °C rispetto a uno standard con una concentrazione nota di LDH. Eseguire le misure di assorbanza fino a quando la reazione non si è avvicinata al completamento, cioè fino a quando l'assorbanza a 340 nm non cambia più nel tempo.
   nota: Questo è il metodo biochimico classico per misurare l'attività dell'LDH. Sebbene il protocollo attuale esegua la reazione a 37 °C, può essere eseguita anche a temperatura ambiente (20-25 °C), il che è consigliabile se si esegue la spettrofotometria manuale. L'attuale protocollo utilizza uno strumento robotico multi-analizzatore, che in modo automatizzato mescola i campioni con la soluzione di lavoro in una piastra a 96 pozzetti e misura l'assorbanza a 340 nm a 37 °C ogni 20 s per 3 minuti. Successivamente, il software dello strumento calcola la concentrazione di LDH, espressa in Unità (U)/L, confrontando la pendenza delle misure di assorbanza nel tempo rispetto a una curva standard ottenuta tramite calibrazione con uno standard di concentrazione nota di LDH. L'intervallo lineare di rilevamento con questo approccio è di 30-1.500 U/L. In alternativa, esiste un'ampia varietà di kit disponibili in commercio per misurare l'LDH. Alcuni di essi si basano sull'accoppiamento della reazione enzimatica alla generazione di prodotti colorimetrici o fluorescenti, consentendo la rilevazione con mezzi diversi dalla spettrofotometria UV e con altri intervalli lineari di rivelazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml e 2 ml	Eppendorf	211-2130 e 211-2120
Piastre a 12 pozzetti	Falcone	353043
Soluzione di distacco cellulare Accumax	Tecnologie cellulari innovative	Codice: A7089	Conservare le aliquote a -20 °C per anni, e in frigo per qualche mese
Bafilomicina A1	Enzo	BML-CM110-0100	Dissolvenza in DMSO
Cellule BJ	ATCC	Codice CRL-2522	Utilizzare al passaggio <30
Albumina sierica bovina (BSA)	VWR	Numero 422361V
Camera di conteggio Burker	Fisher Scientifico	Codice 139-658585
Countess Cell Counting Camera Vetrini	ThermoFisher Scientfic	Codice: C10228
Contacellule automatizzato Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Vetro di copertura per la camera di conteggio Burker	Fisher Scientifico	Codice 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26 pozzetti, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (L x L)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)	Gibco	Codice 24010-043	Carboidrati 0,1% glucosio
Edta	Sigma-Aldrich	E7889
Cuvetta per elettroporazione (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Elettroporatore ad onda di decadimento esponenziale	Apparato BTX Harvard	EMC 630
Siero fetale bovino (FBS)	sigma	F7524	Concentrazione finale del 10% in terreno RPMI 1640
Celle HEK293	ATCC	Codice CRL-1573
Imidazolo	Sigma-Aldrich	Codice: 56750	Autoclavare in autoclave una soluzione da 65 mM e conservare in frigo per mesi
incubatrice; Incubatore a CO2 a calore diretto IR Autoflow	NuAire	NU-5510E
Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX	ThermoFisher	13778150
Celle LNCaP	ATCC	CRL-1740	Utilizzare al passaggio <30
3-metil adenina (3MA)	Sigma-Aldrich	Codice: M9281	Immagazzinare 100 mM in RPMI a -20 °C. Riscaldare il brodo a 65 °C per 10 minuti e utilizzare alla concentrazione finale di 10 mM
Microcentrifuga refrigerata	Beckman Coulter Scienze della vita	368831
Microcentrifuga refrigerata con funzione soft-mode	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 cloridrato (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inibisce l'attività chinasica ULK. Dissolvere in DMSO.
Strumento multianalizzatore MaxMat	Erba Diagnostica	PL-II
Celle MCF7	ATCC	HTB-22
Nadh	Merck-Millipore	Codice 1.24644.001
Nycodenz	Asse-Scudo	1002424
Opti-MEM Siero Ridotto Medium	ThermoFisher	31985062
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	Codice: 20012-019
Puntali per pipette 3 (0,5-20 μl)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART Punte barriera
Puntali per pipette (1-200 μl)	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART Punte barriera
Puntali per pipette (100-1000μl)	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART Punte barriera
Pipette	ThermoFisher	4701070	Kit Finnpipette F2 GLP
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Preparare una soluzione madre da 1 mg/ml in H2O sterile. Questa soluzione è stabile a -20 °C per almeno 1 anno.
piruvato	Merck-Millipore	1066190050
Cellule RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	Codice 21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inibisce la fosfoinositide 3-chinasi di classe III (PIK3C3). Dissolvere in DMSO.
Silenziatore Seleziona Controllo Negativo #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silenziatore Seleziona il siRNA mirato ad ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	S35504
Silencer Select siRNA mirato a FIP200 (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	S22362
Silenziatore Seleziona GABARAPL1 siRNA mirato (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	S24333
Silenziatore Seleziona GABARAPL2 siRNA mirato (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
Sodio fosfato monobasico diidrato (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	Codice 1.06580.1000
Sodio fosfato bibasico diidrato (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	Codice 28014.291
saccarosio	VWR	Numero 443816T	10% di concentrazione finale in acqua; filtrare con filtro da 0,45 μm e conservare in frigo per mesi
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inibisce la pompa SERCA ER Ca2+. Dissolvere in DMSO.
Tritone X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% finale
Trypan Macchia blu 0,4%	Sonde molecolari	T10282
Tripsina-EDTA (0,25% p/v tripsina)	Gibco	Codice 25200-056
Interpolazione-20	Sigma-Aldrich	P2287	0,01% finale