1. Condizioni di coltura per la proteina fluorescente verde che esprime M. tuberculosis mc26206 (mtb-gpp)
NOTA: In tutto questo protocollo viene utilizzato il ceppo auxotrofico derivato da M. tuberculosis H37Rv mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) trasformato con il plasmide pMN437 che esprime gfp (proteina fluorescente verde). È possibile sostituire il ceppo Mtb-GFP con un ceppo wild-type non esprimente gfp per consentire una più facile accessibilità del ceppo per i ricercatori. Tuttavia, l'espressione di gfp è auspicabile per consentire la conferma visiva della fagocitosi e la formazione di aggregati Mtb/macrofagi. Per la conservazione a lungo termine, le Mtb-GFP sono state congelate a -80 °C in terreni 7H9 completi (descritti nella fase 1.1) integrati con glicerolo al 20%.
- Preparare il terreno Mtb-GFP completo (7H9-C) integrando il terreno 7H9 con il 10% di Middlebrook OADC (albumina oleica destrosio catalasi), lo 0,02% di tiloxapol, 24 μg/mL di acido D-pantotenico, 50 μg/mL di L-leucina e 50 μg/mL di igromicina B.
- Scongelare un flaconcino di Mtb-GFP e aggiungere 10 mL di 7H9-C in un pallone da 30 mL di PETG a fondo quadrato.
- Incubare a 37 °C su agitatore rotante (50 giri/min). Effettuare misurazioni della densità ottica (OD600) ogni pochi giorni fino a quando OD600 raggiunge 1,0 (circa 5-8 giorni).
- Diluire e passare la coltura secondo necessità per mantenere un OD600 compreso tra 0,2 e 1,0.
- Per l'infezione, utilizzare una coltura consolidata di Mtb-GFP nella fase di crescita logaritmica (OD600 di 0,6-1). Per evitare fermenti di coltura grumosi, sonicare il pallone di coltura Mtb in un bagno d'acqua (130 W; 3 impulsi da 5 s) una o due volte alla settimana.
2. Condizioni di coltura per le cellule THP-1
- Preparare il terreno cellulare THP-1 completo (RPMI-C) integrando il terreno RPMI 1640 con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente, 2 mM di L-glutammina e 10 mM di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico).
- Incubare le cellule in un matraccio T-75 a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o una citometria a flusso a giorni alterni e mantenere le cellule THP-1 a una densità compresa tra 0,1 e 0,6 milioni per ml.
3. Protocollo di Infezione per Generare Strutture Aggregate di Mtb/Macrofagi
- Preparazione delle cellule THP-1 (per piastra a 96 pozzetti)
- Centrifugare 7 x 106 cellule THP-1 a 250 x g per 5 min. Risospendere in 7 mL di RPMI-C.
- Preparazione Mtb-GFP
- Centrifugare 2,8 x 108 Mtb-GFP a 3.200 x g per 5 minuti in una centrifuga a secchiello oscillante utilizzando una conversione di OD600 1,0 = 3 x 108 batteri/mL.
- Lavare una volta con RPMI-C e centrifugare come al punto 3.2.1.
- Risospendere in 7 mL di RPMI-C e vorticare per 10 s.
- Infezione
NOTA: Vedere la Figura 1 per il modello.
- Preparare una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 200 μl di acqua sterile nelle file A e H e nelle colonne 1 e 12 per un bordo d'acqua per evitare l'evaporazione del terreno di coltura.
- Aggiungere 200 μl di RPMI-C alla colonna 2 (da B2 a G2) per il controllo dello sfondo (vuoto).
- Per infettare, aggiungere la sospensione di Mtb-GFP (passaggio 3.2) alla sospensione cellulare di THP-1 (passaggio 3.1) e mescolare bene mediante pipettaggio. La densità cellulare finale di THP-1 è 5 x 105 per mL e la corrispondente molteplicità di infezione è 40.
- Versare la sospensione THP-1/Mtb-GFP in un serbatoio da 25 mL.
- Aggiungere 200 μl di sospensione THP-1/Mtb-GFP a tutti i restanti 96 pozzetti (da B3 a G11) utilizzando una pipetta multicanale.
nota: Se si lavora con più piastre da 96 pozzetti, risospendere regolarmente la sospensione THP-1/Mtb rimanente nel serbatoio per assicurarsi che venga aggiunta una miscela uniforme a ciascun pozzetto.
- Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 7-10 giorni.
- Cambiare il terreno ogni 2 giorni rimuovendo lentamente 100 μL di terreno esaurito dalla parte superiore di ciascun pozzetto e aggiungendo delicatamente 100 μL di RPMI-C preriscaldato utilizzando una pipetta multicanale. Non risospendere i pozzetti e disturbare gli aggregati Mtb/macrofagi sul fondo dei pozzetti.
- Esaminare visivamente i pozzetti mediante microscopia a fluorescenza (obiettivo 4-10X) ogni giorno, prendendo nota delle dimensioni degli aggregati di Mtb/macrofagi. Entro il giorno 7-10, gli aggregati di Mtb/macrofagi dovrebbero essere sufficientemente grandi (fare riferimento alla Figura 2 per riferimento) per procedere con i test di efficacia del farmaco (Sezione 4).
- Se lo si desidera, è possibile acquisire immagini dei 96 pozzetti utilizzando un sistema automatizzato di imaging cellulare dotato di set di filtri GFP e in campo chiaro per documentare la formazione di aggregati Mtb/macrofagi><.
nota: Se gli utenti non hanno accesso a un sistema di imaging automatizzato, le immagini dei pozzetti rappresentativi possono essere acquisite utilizzando qualsiasi microscopio appropriato con funzionalità GFP e campo chiaro.
4. Saggio di inibizione della crescita per valutare l'efficacia dei farmaci contro Mtb derivato da aggregati di Mtb/macrofagi
- Preparazione del farmaco (condizioni in triplice copia per due farmaci)
NOTA: Vedere la Figura 1A per il modello.
- In una piastra separata da 96 pozzetti, aggiungere 125 μl di terreno 7H9-C da B2 a G10.
- Preparare due farmaci al doppio della concentrazione finale massima desiderata in 1 mL di 7H9-C per tenere conto della diluizione al punto 4.2.4.
- Aggiungere 250 μl di ciascun farmaco ai pozzetti B11-C11-D11 ed E11-F11-G11, rispettivamente per i trattamenti in triplice copiato.
- Utilizzando una pipetta multicanale, diluire in serie i farmaci in esame due volte spostando 125 μl da B11-G11 a B10-G10. Mescolare pipettando 5 volte ad ogni passaggio.
- Continuare a spostare 125 μl da una colonna all'altra (da destra a sinistra) attraverso la piastra e fermarsi dopo la colonna 4.
- Dopo aver miscelato la colonna 4, gettare 125 μl in un contenitore per rifiuti. Le colonne 2 e 3 non devono contenere alcun farmaco per consentire l'uso come sfondo (bianco) e controlli di crescita positivi.
nota: In alternativa, seguire il modello nella Figura 1B per testare le librerie di farmaci. Ogni piastra a 96 pozzetti può contenere 58 farmaci a una singola concentrazione. Preparare questa piastra per farmaci utilizzando il doppio della concentrazione finale desiderata poiché verrà diluita a metà nel passaggio 4.2.4.
- Trattamento farmacologico:
- Recuperare la piastra a 96 pozzetti contenente i macrofagi infetti da Mtb (aggregati Mtb/macrofagi).
- Decantare accuratamente tutti i pozzetti pertinenti (da B2 a G11) con una pipetta multicanale. Eseguire questa operazione in due fasi: in primo luogo, rimuovere 150 μl senza inclinare la piastra, quindi rimuovere il terreno rimanente (~50 μl) inclinando la piastra e inserendo la punta della pipetta nel bordo inferiore del pozzetto. Poiché gli aggregati di Mtb/macrofagi sono aderenti al fondo del pozzo, nessun materiale dovrebbe andare perso.
- Aggiungere delicatamente 100 μl di terreno 7H9-C a tutti i pozzetti pertinenti (da B2 a G11) della piastra contenente gli aggregati Mtb/macrofagi.
- Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 μl dalla piastra a 96 pozzetti contenente il farmaco (passaggio 4.1) ai pozzetti corrispondenti della piastra di infezione.
- Mettere in un sacchetto sigillato e incubare per 3 giorni a 37 °C.
5. Quantificazione dell'efficacia del farmaco utilizzando il test di microtitolazione della resazurina
- Preparare la soluzione madre di resazurina a una concentrazione finale di 0,8 mg/mL in H2O. Filtrare attraverso una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) di dimensioni pari a 0,22 μm per la sterilizzazione.
- Preparare la soluzione di lavoro della resazurina mescolando la soluzione madre di resazurina, H2O e Tween-80 (soluzione al 20% in H2O) in un rapporto 2:1:1. Le concentrazioni finali sono 0,4 mg/mL di resazurina e 5% di Tween-80.
- Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza a 530 nm di eccitazione e 590 nm di emissione ogni 30 minuti per 24 ore a 37 °C. Preriscaldare il lettore di piastre a 37 °C.
- Aggiungere 20 μl di soluzione di lavoro di resazurina a tutti i pozzetti pertinenti (da B2 a G11) della piastra trattata con il farmaco (passaggio 4.11) utilizzando una pipetta multicanale.
- Posizionare la piastra sul lettore di piastre e avviare il programma impostato al punto 5.3.
nota: Per facilitare l'elaborazione di elevati volumi di piastre di analisi, è sufficiente sviluppare il test in un incubatore a 37 °C ed eseguire singole letture a fluorescenza ogni 24 ore. Ciò è applicabile anche agli utenti che non hanno accesso a un lettore di piastre con capacità cinetiche e di incubazione.
