Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Giorno 1
NOTA: Eseguire tutti i passaggi descritti di seguito in una cabina di biosicurezza sterile a flusso laminare utilizzata per la coltura di tessuti in un laboratorio BSL-2.
- Scongelare i campioni di siero a temperatura ambiente e trasferire 100 μl di ciascun campione di siero in una provetta sterile. Inattivare il calore per 30 minuti a 56°C a bagnomaria o in termomiscelatore a temperatura regolabile. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte del campione di siero da 1:1 a 1:1.000 utilizzando RPMI-10 a freddo (RPMI con il 10% di siero fetale bovino).
- Trasferire 10 μl di campione di siero diluito in serie in ciascun pozzetto di una piastra sterile con fondo a V a 96 pozzetti. Includere due serie di pozzetti di controllo, RPMI-10 solo con RVP e senza campione di siero, e RPMI-10 solo senza RVP e senza campione di siero. Impostare ogni campione di siero e i controlli RPMI-10 in triplicati.
- Togliere gli RVP Dengue-1, 2, 3 e 4 dal congelatore a -80 °C e scongelarli a bagnomaria a 37 °C. Trasferire immediatamente gli RVP scongelati nel ghiaccio. Ottenere circa 170 μL di RVP per ogni campione di siero (10 μL di RVPs x 3 pozzetti per ogni diluizione del siero (1:1, 1:10, 1:100, 1:1.000) e 10 μL di RVPs x 3 pozzetti per ciascuno dei pozzetti RPMI-10 con solo pozzetti di controllo RVP).
- Pipettare 10 μl di RVP in ciascun pozzetto della piastra con fondo a V a 96 pozzetti contenente il campione di siero e nei pozzetti di controllo RPMI-10 con RVP (senza siero). Non aggiungere RVP solo ai pozzetti RPMI-10 (nessun campione di siero e nessun RVP). Miscelare accuratamente pipettando su e giù 5-10 volte. Aggiungere 10 μL di RPMI-10 freddo al posto degli RVP a ciascun pozzetto di controllo solo RPMI-10 freddo (nessun campione di siero e nessun RVP).
- Trasferire la piastra con fondo a V a 96 pozzetti in un incubatore e incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in presenza del 5% di CO2. Durante l'incubazione della piastra con fondo a V a 96 pozzetti, pulire la superficie della cappa di biosicurezza con etanolo al 70% e far funzionare la luce UV per 15 minuti.
- Estrarre dall'incubatore un pallone T75 completamente confluente di cellule K562, mescolare bene le cellule con una pipetta sterile da 5 ml e trasferire 5 ml di cellule in una provetta conica sterile da 15 ml.
nota: Le cellule K562 sono mantenute in RPMI-10 e subcoltivate a 1 x 106/mL.
- Contare il numero di cellule rimuovendo 10 μL di cellule dalla provetta conica sterile da 15 mL e mescolare con 10 μL di blu di tripano. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare il numero totale di cellule nella provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare il conico da 15 mL con le cellule a ~1.200 x g per 10 minuti, decantare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI-10 caldo a una concentrazione di 80.000 cellule/30 μL di terreno (2,66 x 106 cellule/mL).
- Rimuovere la piastra con fondo a V a 96 pozzetti dall'incubatore (passaggio 1.6), trasferire 30 μl di cellule K562 in ciascun pozzetto della piastra con fondo a V a 96 pozzetti e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5-10 volte. Trasferire la piastra con fondo a V a 96 pozzetti in un incubatore e incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in presenza del 5% di CO2 .
- Dopo l'incubazione per 1 ora, rimuovere la piastra con fondo a V a 96 pozzetti dall'incubatore e centrifugare a ~1.200 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare il terreno dai pozzetti capovolgendo la piastra in un contenitore contenente il 10% di candeggina.
- Lavare le cellule in ciascun pozzetto risospendendole in 125 μL di RPMI-10 caldo, mescolare accuratamente con una pipetta e centrifugare la piastra a ~1.200 x g per 5 minuti. Decantare il terreno capovolgendo la piastra in un contenitore contenente il 10% di candeggina. Ripetere questa fase di lavaggio due volte.
- Dopo il lavaggio, aggiungere 100 μL di RPMI-10 caldo a ciascun pozzetto, mescolare su e giù con la pipetta e incubare la piastra per 48 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2.
2. Giorno 3
- Rimuovere la piastra con fondo a V a 96 pozzetti contenente 100 μL di cellule e terreni/pozzetti dall'incubatore e spostarla in una cappa di biosicurezza. Utilizzando una pipetta multicanale, miscelare il contenuto di ciascun pozzetto e trasferire le cellule e i terreni in una piastra con fondo a U da 96 pozzetti o in provette in polipropilene da 5 mL pre-marcate.
- Sciacquare ogni pozzetto nella piastra con fondo a V a 96 pozzetti con 100 μl di paraformaldeide (PFA) all'1% in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e trasferire nei rispettivi pozzetti nella piastra con fondo a U a 96 pozzetti o in provette in polipropilene da 5 mL marcate dal passaggio 2.1 per ottenere una concentrazione finale dello 0,5% di PFA/pozzetto o provetta. Mescolare accuratamente con una pipetta multicanale, coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciarla riposare nell'incubatore per 30 minuti per fissare le cellule.
- Preparare il citometro a flusso (vedere ad esempio la Tabella dei materiali) facendo scorrere le cellule K562 non colorate per calibrare la dispersione laterale e anteriore insieme alle impostazioni di fluorescenza. L'unico canale di fluorescenza richiesto è FL1, poiché la GFP è l'unica fluorescenza emessa dalle cellule. Acquisisci ~30.000-50.000 cellule da ogni campione.
nota: Per l'acquisizione dei dati è possibile utilizzare qualsiasi citometro a flusso in grado di leggere una singola fluorescenza, poiché le cellule infettate da RVP emetteranno solo fluorescenza verde a causa della presenza di GFP e non sono necessari altri canali di fluorescenza.
3. Analisi dei dati
- Analizza i dati acquisiti sul citometro a flusso utilizzando qualsiasi software di analisi della citometria a flusso (vedi Tabella dei materiali).
- Impostare il primo gate in base a FSC-A (forward scatter – area) vs FSC-H (forward scatter – height) per includere singole celle ed escludere i doppietti autofluorescenti dall'analisi. Quindi, gate delle celle singoletto-gate basate su SSC-A (side scatter – area) rispetto a FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti.
- Analizzare le cellule gated SSC-A vs FSC-A per l'espressione di GFP in base a SSC-A vs GFP-A. Determinare la percentuale di cellule GFP+ per ogni diluizione del siero e dei campioni di controllo impostando un cancello attorno alle cellule GFP+.
- Determinare la percentuale media di cellule GFP+ per ogni pozzetto di diluizione e controllo del campione di siero dividendo per 3 la percentuale totale di cellule GFP+ nei pozzetti triplicati.
- Calcolare l'aumento della piega dell'infezione dividendo la percentuale media di cellule GFP+ nei campioni di siero per ciascuna diluizione per la percentuale media di cellule GFP+ nei pozzetti di controllo RPMI-10 con RVP (nessun campione di siero).
- Miglioramento del ripiegamento del grafico (asse y) rispetto alla diluizione (asse x) ed esecuzione di analisi statistiche utilizzando ANOVA seguita dal test post-hoc di Tukey per confronti multipli.
