Un test per lo screening di nanoparticelle bioattive per l'inibizione della segnalazione del recettore toll-like

Abstract

Fonte: Yang, H., et al. Screening di nanoparticelle bioattive nelle cellule immunitarie fagocitiche per inibitori della segnalazione del recettore Toll-like. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra un test basato su cellule reporter per lo screening di potenziali nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione del recettore Toll-like (TLR). Il test prevede l'introduzione di lipopolisaccaridi (LPS) mescolati con ibridi di nanoparticelle peptidico-oro ai macrofagi reporter che esprimono le proteine reporter: fosfatasi alcalina embrionale secreta (SEAP) e luciferasi. La riduzione del segnale TLR indotto da LPS mediata dagli ibridi è determinata misurando i segnali reporter.

Protocollo

1. Screening per potenziali nano-inibitori di TLR4 utilizzando le cellule reporter

NOTA: Poiché la segnalazione TLR4 utilizza sia percorsi terrestri dipendenti da MyD88 che TRIF, viene selezionato come obiettivo primario per comprendere un'ampia gamma di percorsi di segnalazione TLR. Le cellule reporter THP-1-XBlue sono utilizzate principalmente per esaminare l'attivazione di NF-κB/AP-1 mentre le celle THP-1-Dual sono per l'attivazione di IRF dalla trasduzione del segnale TRIF-dipendente.

1. Identificare la dose ottimale di LPS generando una curva dose-risposta prima dello screening.
   1. Di....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cella reporter THP-1-XBlue	InvivoGen	THPX-SP	mantenere il passaggio della coltura cellulare al di sotto di 20
THP-1-Cella a doppio repoter	InvivoGen	THPD-NFI	mantenere il passaggio della coltura cellulare al di sotto di 20
RPMI-1640 (senza L-glutammina)	GE Assistenza sanitaria	SH30096.02	Riscaldare fino a 37 °C prima dell'uso; aggiungere integratori per ottenere un terreno completo R10
Siero fetale bovino (qualificato)	Thermo Fisher Scientifico	12484028	Calore inattivato; 10% in RPMI-1640
L-glutammina	Thermo Fisher Scientifico	SH30034.02	2 mM nel mezzo completo R10
Piruvato di sodio	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11360-070	1 mM nel mezzo completo R10
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1X, senza calcio, magnesio	GE Assistenza sanitaria	SH30028.02	Utilizzo per il lavaggio cellulare e la preparazione dei reagenti
QUANTI-Blu	InvivoGen	REP-QB1	Substrato SEAP
QUANTI-Luc	InvivoGen	REP-QLC2	Substrato della luciferasi
Zeocin	InvivoGen	ANT-ZN-1	Antibiotici di selezione per cellule reporter
Blasticidina	InvivoGen	Anti-BL-1	Antibiotici di selezione per cellule reporter
Dimetilsolfossido (DMSO) per la biologia molecolare	Sigmal-Aldrich	D8418-100ML	Utilizzare per la preparazione dei reagenti
Lipopolisaccaride (LPS) da E. coli K12	InvivoGen	tlrl-eklps	Legante TLR4
Flagellina da S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapura	InvivoGen	TLRL-epstfla	Legante TLR5
Lettore di micropiastre SpectraMax Plus 384	Dispositivi molecolari	N/A	Leggi il test colorimetrico
Lettore di micropiastre multimodale Infinite M200 Pro con iniettori	Tecan	N/A	Leggi luminiscience
Piastra per saggio Costar, 96 pozzetti bianca con fondo piatto trasparente, trattamento con coltura tissutale	Costar di Corning	3903	Utilizzato per il saggio di luminiscenza