1. Screening per potenziali nano-inibitori di TLR4 utilizzando le cellule reporter
NOTA: Poiché la segnalazione TLR4 utilizza sia percorsi terrestri dipendenti da MyD88 che TRIF, viene selezionato come obiettivo primario per comprendere un'ampia gamma di percorsi di segnalazione TLR. Le cellule reporter THP-1-XBlue sono utilizzate principalmente per esaminare l'attivazione di NF-κB/AP-1 mentre le celle THP-1-Dual sono per l'attivazione di IRF dalla trasduzione del segnale TRIF-dipendente.
- Identificare la dose ottimale di LPS generando una curva dose-risposta prima dello screening.
- Diluire la soluzione di LPS di lavoro a una concentrazione finale di 0,01 - 100 ng/mL in terreno R10 (diluire in scala log10). Disporre il design della piastra ed effettuare la diluizione in una piastra di coltura a fondo tondo a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia un minimo di 110 μL di soluzione dopo la diluizione.
- Rimuovere delicatamente il terreno di coltura dalla piastra con semi cellulari utilizzando un aspiratore a vuoto.
- Trasferire l'LPS contenente il terreno R10 preparato nella piastra di diluizione (1.1.1) nella piastra di coltura secondo la disposizione dei campioni. Incubare la piastra a 37 °C (in un incubatore per colture cellulari) per 24 ore.
- A 24 ore, trasferire con cura i surnatanti (80 μL/pozzetto) in una nuova piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Eseguire immediatamente il test colorimetrico e/o di luminescenza della luciferasi su queste soluzioni o conservarle a 4 °C (diverse ore) o -20 °C (giorni) prima dello sviluppo del saggio.
nota: Il design del layout della piastra dovrebbe essere semplice e chiaro per l'esperimento e l'analisi dei dati. Per ogni condizione, dovrebbero essere prese in considerazione 2-4 repliche. Includi sempre un gruppo di controllo negativo (LPS null). Si consiglia di utilizzare le cellule THP-1-XBlue per l'attivazione di NF-κB/AP-1 poiché le cellule Dual hanno un background relativamente elevato di attivazione di NF-κB/AP-1 dopo essere state differenziate in macrofagi. Tuttavia, è possibile utilizzare le celle doppie per segnalare sia l'attivazione di NF-κB/AP-1 che quella IRF.
- Sviluppare il test colorimetrico per l'attivazione di NF-κB/AP-1 e il test di luminescenza della luciferasi per l'attivazione di IRF.
- Per valutare l'attivazione di NF-κB/AP-1, trasferire 20 μL di surnatante di ciascun campione in una nuova piastra di coltura a fondo piatto a 96 pozzetti e aggiungere 180 μL di soluzione di substrato SEAP preriscaldata in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C per 1 - 2 ore per consentire lo sviluppo del colore (dal rosa al blu scuro). Raccogliere l'assorbimento a 655 nm su un lettore di piastre.
cautela: Il tempo di incubazione può essere variato in base allo sviluppo del colore (30 minuti fino all'incubazione notturna). Si consiglia di attendere che la densità ottica (O.D.) del colore più scuro raggiunga superiore a 1 evitando la saturazione dello sviluppo del colore (O.D >3).
- Per l'analisi dell'attivazione dell'IRF, trasferire 10 μL di surnatante di ciascun campione in una piastra bianca trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti. Aggiungere la soluzione di luciferasi (50 μL) e raccogliere immediatamente la luminescenza bene per well.
nota: Si consiglia vivamente di utilizzare un lettore di piastre a luminescenza con funzione di iniezione automatica per garantire la coerenza nella lettura della luminescenza da pozzetto a pozzetto e da piastra a piastra. Se le soluzioni del substrato vengono iniettate manualmente, assicurarsi che il tempo di incubazione e l'impostazione della lettura siano coerenti per ciascun pozzetto.
- Condurre il test di screening su vari ibridi peptide-GNP con stimolazione LPS a 10 ng/mL (basata su 1,1). Seguire la stessa procedura in 1.2 per lo sviluppo del saggio reporter.
- Concentrare gli ibridi peptide-GNP a 200 nM in un terreno R10 utilizzando il metodo della centrifugazione. Centrifugare 20 volumi della soluzione ibrida (10 nM) a 18.000 x g per 30 minuti ed eliminare con cura i surnatanti. Raccogli gli ibridi (sul fondo del tubo) in un tubo, lavali due volte con PBS e rimetti in sospensione gli ibridi in un volume del terreno R10.
- Miscelare volumi uguali degli ibridi concentrati e dell'LPS (20 ng/mL) contenente terreno R10 in modo da ottenere una concentrazione finale degli ibridi e dell'LPS rispettivamente di 100 nM e 10 ng/mL.
- Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura e aggiungere 100 μl della soluzione miscelata in ciascun pozzetto (3 repliche per ogni condizione); includere un controllo negativo (solo terreno) e un controllo LPS (10 ng/mL di LPS senza ibridi).
- Dopo 24 ore di incubazione a 37 °C, trasferire il terreno di ciascun pozzetto in una provetta e centrifugare le provette a 18.000 x g, 4 °C per 30 minuti. Raccogliere i surnatanti (50-80 μl/provetta) in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti ed eseguire il saggio reporter come descritto al punto 3.2.
cautela: Quando si scartano i surnatanti dopo la centrifugazione, non agitare gli ibridi sul fondo della provetta.
nota: La centrifugazione nella fase 1.3.4 è molto importante per rimuovere gli ibridi di nanoparticelle non internalizzati dal terreno di coltura e può evitare l'interferenza degli ibridi con le letture colorimetriche/di luminescenza. Questo perché le nanoparticelle d'oro possono assorbire ampie lunghezze d'onda della luce a seconda delle loro dimensioni e agglomerazione.
2. Validare l'Effetto Inibitorio dei Potenziali Candidati
NOTA: Per confermare l'effetto inibitorio dei potenziali candidati dallo screening, vengono impiegati due approcci. Uno consiste nell'esaminare le risposte alla dose degli stimolanti (LPS) a una concentrazione ibrida fissa (o viceversa); l'altro è quello di esaminare direttamente l'inibizione dei segnali NF-κB/AP-1 e IRF3 tramite immunoblotting.
- Nel primo approccio, eseguire il saggio reporter con 100 nM di ibridi guida e due concentrazioni di LPS a 1 ng/mL e 10 ng/mL seguendo le stesse procedure descritte al punto 1.3. Includere un ibrido inattivo (in base ai risultati dello screening) come controllo ibrido per il confronto.
- Per l'approccio dell'immunoblotting, si prega di seguire le procedure sperimentali standard.
- Coltivare le cellule THP-1 in terreno R10, seminare le cellule in una piastra di coltura a 12 pozzetti (2 x 106 cellule/pozzetto) e differenziarle in macrofagi trattando le cellule con 50 ng/mL di PMA per 24 ore, seguite da un riposo di 2 giorni.
- Dopo la differenziazione cellulare, stimolare le cellule con 10 ng/mL di LPS con/senza gli ibridi (100 nM) nel tempo (fino a 4 ore). In vari momenti (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 minuti), preparare i lisati cellulari per l'immunoblotting. Includere un ibrido inattivo come controllo.
- Sondare i segnali di IκBα, p65 fosforilata e IRF3 fosforilata per esaminare l'effetto inibitorio degli ibridi di piombo sull'attivazione di NF-κB e IRF3. Sondare i segnali β-actina e IRF3 totale come controlli interni.
nota: La trasduzione del segnale avviene spesso molto più velocemente (in poche ore) rispetto all'espressione degli enzimi reporter SEAP e luciferasi (24 ore). Si consiglia vivamente di eseguire anche un test di vitalità degli ibridi testati a 24 ore come altro metodo di convalida.
3. Valutazione della specificità del TLR
NOTA: Per studiare la specificità TLR dell'ibrido peptide-GNP principale, vengono testate altre vie di segnalazione TLR, tra cui TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 sono esclusi perché i macrofagi derivati da THP-1 non rispondono bene alla stimolazione di questi TLR a causa della mancanza di espressione di TLR7, 8 e 9 nei macrofagi.
- Testare varie concentrazioni (da 1 ng/mL a 25 μg/mL) dei ligandi specifici per TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) e TLR5 (flagellina) su entrambi i macrofagi derivati da cellule reporter per ottenere la concentrazione ottimale seguendo la stessa procedura in 1.1 e 1.2.
- Trattare le cellule con le miscele dell'ibrido di piombo (100 nM) e di ciascun ligando TLR alla concentrazione ottenuta da 3.1 per valutare la specificità inibitoria dell'ibrido di piombo secondo la procedura sperimentale descritta in 1.3. Includere l'ibrido inattivo come controllo per il confronto.
