Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento degli organi
NOTA: Il virus non è stabile a temperatura ambiente (RT), quindi il numero di animali raccolti contemporaneamente deve essere pianificato attentamente per preservare i titoli virali.
- Infettare i topi utilizzando la dose e la via scelte, in base al fenotipo richiesto. Per questo protocollo, infettare topi C57BL/6 maschi e femmine di tipo I di 8-10 settimane con deficit del recettore dell'interferone (Ifnar1-/-).
- Anestetizzare i topi Ifnar1-/- con un cocktail di ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Testare il riflesso del pedale con un pizzico deciso per confermare l'anestesia. Somministrare 1 x 105 unità di formazione del fuoco (FFU) di ZIKV in 50 μL per via sottocutanea (SC) tramite il poggiapiedi.
- Preparare tutto il materiale necessario per il raccolto il giorno prima di 2 forbici, pinze e 20 ml di etanolo al 70% (EtOH) in un conico da 50 ml per la disinfezione degli strumenti.
- Preparare siringhe e aghi: una siringa da 20 ml per la perfusione, aghi da 23 G (circa 1 per gabbia) e una siringa da 1 ml con aghi da 25 G (1 per 3-5 topi). Prima di pesare i tubi, aggiungere perline di acciaio (nel cappuccio) a tubi con tappo a vite O-ring da 1,5 ml (uno per ogni organo). Le provette devono essere adatte all'omogeneizzazione.
- Preparare il giorno del raccolto i materiali necessari per la perfusione e il congelamento degli organi.
- Riempi un secchiello del ghiaccio con ghiaccio secco e il 70% di EtOH per fare un bagno di ghiaccio. Preparare soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) supponendo che siano necessari 25-30 ml per topo di PBS per ogni perfusione, 5-10 ml per il midollo spinale). Procurati l'anestesia, un cocktail di ketamina e xilazina e assumi 300 μl per topo. Posizionare tutto il materiale e le eventuali provette aggiuntive necessarie per la citometria a flusso, ecc., in un contenitore secondario per il trasporto alla struttura per animali.
- Seguire tutte le procedure necessarie per l'ingresso, compreso indossare e togliere i dispositivi di protezione individuale durante l'ingresso e l'uscita nella struttura per animali.
cautela: Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza certificata all'interno di un laboratorio di biosicurezza di livello 2 (BSL-2).
- Somministrare l'anestesia, 200-500 μL, per via intraperitoneale a seconda delle dimensioni e del peso dell'animale. Se lavori da solo, somministra l'anestesia a un animale alla volta per evitare di uccidere gli animali prima del prelievo di organi.
- Confermare la dose di anestesia pizzicando l'alluce con una pinza per valutare il riflesso del pedale. Non continuare a meno che non risponda completamente. Usa gli spilli per fissare il mouse a una tavola di cera. A questo punto, immergere il topo in etanolo al 70% per evitare la contaminazione dei peli durante la procedura di prelievo degli organi.
- Sanguinamento terminale da puntura cardiaca.
- Usando le forbici e le pinze, apri l'animale attraverso la cavità toracica per esporre il cuore. Raccogli il sangue tramite puntura cardiaca (~800 μL), che può essere utilizzato per diversi saggi tra cui chimica clinica, ematologia, citometria a flusso per rilevare risposte specifiche dell'antigene e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) per l'analisi del numero di copie virali.
- Per l'analisi dell'RNA virale mediante qRT-PCR, raccogliere il sangue in una provetta EDTA se si estrae da sangue intero o in una provetta da microcentrifuga se si estrae dal siero. (Per il siero, centrifugare la provetta alla massima velocità in una centrifuga, a temperatura ambiente, per 20 minuti e rimuovere il siero in una provetta separata). Aggiungere una poliacrilammide lineare come vettore al campione di siero dopo aver terminato. L'RNA può quindi essere analizzato o conservato a -80 °C per essere ulteriormente elaborato in un secondo momento.
- Riempire la siringa da 20 ml con PBS, a temperatura ambiente (o 37 °C) e perfondere i topi inserendo l'ago a farfalla nel ventricolo sinistro. Forare l'atrio destro per consentire l'uscita di sangue e PBS. Somministrare lentamente il PBS controllando il colore del fegato per confermare che l'animale sia completamente perfuso. Il fegato dovrebbe cambiare dal rosso intenso al rosa salmone.
- Se si preparano gli organi per l'istologia, lasciare l'ago a farfalla in posizione e poi perfondere con 20 ml di paraformaldeide ghiacciata al 4%. In tal caso, è conveniente collegare la siringa a un rubinetto a 3 vie con entrambe le siringhe attaccate ad essa, accendendo e spegnendo la valvola mentre si alterna tra PBS e PFA.
- Raccogli gli organi in tubi etichettati e pesati. Per gli organi periferici, seguire un ordine stabilito per il prelievo: fegato, milza, reni e polmoni.
- Prendete un solo lobo dal fegato, non importa quale, ma per tutti gli esperimenti cercate sempre di prendere lo stesso lobo con un pezzo della stessa dimensione. Allo stesso modo, per i reni e i polmoni, prendi lo stesso rene e polmone. Se anche la citometria a flusso deve essere completata, qualsiasi organo può essere tagliato a metà. Conservare la metà da utilizzare per la citometria nel terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a temperatura ambiente fino al completamento del raccolto.
- Subito dopo il prelievo, mettere ogni organo in una provetta etichettata e metterlo nel bagno di ghiaccio secco. Il titolo del virus si riduce nel tempo a temperatura ambiente, quindi la quantità di tempo necessaria per prelevare gli organi è estremamente importante. Ci deve essere coerenza tra i topi, quindi dopo la sicurezza, la priorità successiva è la velocità.
nota: Se si prelevano organi per titoli virali, è molto utile avere un secondo individuo che preleva il cervello a questo punto, per preservare i titoli virali.
- Rimuovere gli organi rimanenti dalla cavità del corpo del topo per accedere alla colonna vertebrale e al cranio.
- Rimuovi il mouse dal tabellone e rimuovi la pelle, quindi rimuovi le braccia e le gambe.
Rimuovere la testa del topo con forbici da decapitazione, smussate o chirurgiche per raccogliere il cervello tagliando il cranio con le forbici seghettate di LaGrange attraverso il forame magno. Quindi, stacca il cranio con una pinza e scava il cervello con una spatola.
- Usando forbici forti e smussate, rimuovi le costole e le altre ossa che circondano la colonna vertebrale. Quindi, tagliare l'osso pelvico, esponendo il forame vertebrale a livello lombare. La piccola punta del midollo spinale dovrebbe essere visibile a questo punto.
- Utilizzare una siringa da 10 ml riempita con PBS e un ago da 18 G per espellere il midollo spinale "lavando" il midollo dal rachide lombare a quello cervicale su una piastra di Petri.
- Con attenzione, posizionare la punta smussata dell'ago all'interno del forame vertebrale, evitando una pressione eccessiva per evitare che l'ago attraversi il corpo vertebrale. Tenere premuto con forza per esercitare pressione sul corpo vertebrale e sull'ago e premere lo stantuffo della siringa per espellere il cordone. Trasferire immediatamente il midollo spinale nel tubo etichettato e metterlo nel bagno di ghiaccio secco.
- Ripetere la procedura con tutti gli animali fino al completamento della raccolta. Posizionare gli strumenti di raccolta nell'etanolo al 70% tra gli animali. Concentrati su costanza e velocità. Il periodo di tempo tra il prelievo di ciascun organo dovrebbe rimanere costante in modo da non influenzare i risultati del titolo virale.
- Al termine, disinfettare la cabina di biosicurezza e tutto il materiale prima di rimuoverlo dalla struttura per animali.
- Rimuovere ogni tubo dal bagno di ghiaccio e pesare i tubi per determinare il peso dell'organo. Per determinare il peso degli organi, sottrarre il peso del tubo vuoto dal peso del tubo contenente l'organo.
NOTA: A questo punto, gli organi possono essere congelati a -80 °C per essere ulteriormente lavorati in un secondo momento oppure gli organi possono essere omogeneizzati immediatamente prima di congelare le singole aliquote. Il congelamento-scongelamento dei campioni più volte riduce il titolo virale. Pertanto, è importante eseguire la stessa procedura per tutti gli esperimenti all'interno di un singolo progetto.
2. Omogeneizzazione degli organi
- Preparare 3 provette da 1,5 ml con tappo a scatto per ciascun organo da omogeneizzare.
- Se i campioni non vengono omogeneizzati subito dopo la raccolta, rimuovere le provette da -80 °C. I campioni non devono essere scongelati per omogeneizzarli.
- Mettere i campioni sul ghiaccio per mantenerli freddi e ridurre al minimo la perdita di titolo virale. Quindi, aggiungere 1 mL di DMEM freddo contenente il 5% di FBS a ciascuna provetta contenente l'organo.
- Battere immediatamente i tubi in un battitore di perline secondo le istruzioni del produttore. Omogeneizzare tutti gli organi con perline d'acciaio in uno strumento omogeneizzatore di perline. Verificare che ogni organo sia stato completamente omogeneizzato.
- Centrifugare i detriti d'organo in una microfuga a 12.000 x g per 5 minuti in una microfuga che è stata raffreddata a 8 °C. Quindi rimetti i tubi nel secchiello del ghiaccio. Nella cabina di biosicurezza, aliquotare i campioni in provette per i saggi necessari. Quindi rimetti i tubi nel secchiello del ghiaccio.
- Per il saggio di formazione del focus, aliquotare 500 μl in una provetta marcata. Quindi posizionare le provette nella griglia su un secchiello per il ghiaccio. Aliquotare 50 μl in una provetta per RNA per RT-PCR quantitativa fluorogenica (qRT-PCR) per misurare il numero di copie del genoma virale.
- Isolare l'RNA totale dagli organi degli animali infetti utilizzando un kit di isolamento dell'RNA commerciale. Determinare l'RNA virale del flavivirus utilizzando i set di sonde primer specifici per ZIKV, che riconosce sequenze uniche in ciascun genoma di flavivirus. Determinare il numero di copie virali utilizzando un plasmide di controllo della copia contenente un RNA a filamento singolo positivo definito generato in vitro utilizzando la polimerasi T7 contenente le sequenze bersaglio ZIKV.
- Aliquotare il campione rimanente, che è di circa 300 μl, nella terza provetta e conservarlo a -80 °C se necessario.
NOTA: Se i campioni non sono stati precedentemente congelati, congelare a -80 °C. Se i campioni sono stati precedentemente congelati, continuare con il saggio di formazione del fuoco e/o l'isolamento dell'RNA prima di interrompere.
3. Saggio di formazione del fuoco del virus Zika
NOTA: È importante includere un controllo senza virus e un controllo positivo. Il controllo positivo è una serie di diluizione di un ceppo virale con una concentrazione nota. Non è necessario che tutti i controlli siano sulla stessa piastra, ma man mano che il test diventa più grande di 5 piastre, è necessario aggiungere più controlli e distribuirli tra le piastre. Fare attenzione a non graffiare il monostrato con i puntali delle pipette o con un lavaggio energico. Più organi possono essere titolati nello stesso giorno o in giorni diversi. Tuttavia, un singolo organo non deve essere titolato per più giorni perché diverse condizioni di dosaggio possono influire sul titolo virale. Si consiglia vivamente di eseguire un singolo organo in un solo giorno.
- Prima del giorno del test, preparare le cellule e i reagenti necessari per il test di formazione del fuoco.
- Preparare terreni di coltura contenenti 500 mL di DMEM con 5 mL di HEPES e 25 mL di FBS. Avere cellule dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) che crescono in terreni di crescita a 37 °C, 5% di CO2 prima dell'inizio del test. Le cellule Vero non devono essere a passaggio alto o essere cresciute oltre il 100% di confluenza prima dell'inizio del saggio.
- Preparare 500 mL di una soluzione di metilcellulosa al 2% sterilizzando in autoclave un flacone di vetro da 1 L con 10 g di metilcellulosa e una barra di agitazione grande e un flacone di vetro separato da 1 L con 500 mL di H2O. Se l'acqua sterilizzata in autoclave si è raffreddata, riscaldarla nel microonde fino a quando la bottiglia non è calda al tatto, ma non bollente.
- Versare delicatamente acqua tiepida/calda in un flacone di metilcellulosa mentre si è nella cappa di coltura tissutale. Tappare parzialmente il flacone e mescolare sulla piastra riscaldante fino a quando la metilcellulosa è in soluzione (1-4 ore). Aliquotare la soluzione di metilcellulosa al 2% in una provetta conica sterile da 50 mL. La metilcellulosa al 2% può essere conservata a 4 °C fino al momento del bisogno.
- Preparare una soluzione di Paraformaldeide al 5% in PBS per il fissaggio delle piastre e conservarla a 4 °C fino al momento del bisogno. Preparare un tampone di lavaggio per test di focalizzazione 1x aggiungendo lo 0,05% di Triton X-100 al PBS e conservarlo in RT. Preparare un tampone di colorazione FFA 1x aggiungendo 1 mg/mL di saponina al PBS e conservarlo a 4 °C fino al momento del bisogno. Questi possono essere preparati con una o due settimane di anticipo.
- Calcolare il numero di piastre a fondo piatto da 96 pozzetti necessarie per il test in modo tale che ogni organo sia placcato in triplice copia. Includi abbastanza pozzetti aggiuntivi per i controlli positivi e negativi.
- Far crescere un numero sufficiente di cellule Vero nei terreni di coltura per completare il test progettato. Tripsinizzare le cellule Vero e contarle risospendendole a 1,5 x 105 cellule per mL in terreno di crescita. Piastra delle cellule Vero nelle piastre a fondo piatto da 96 pozzetti a 3,0 x 104 cellule Vero-WHO/pozzetto in terreno di crescita aggiungendo 200 μl per pozzetto.
- Incubare le piastre a 37°C al 5% di CO2 durante la notte, assicurarsi che le piastre siano a livello nell'incubatore in modo che le cellule siano distribuite uniformemente all'interno del pozzetto.
NOTA: Ogni laboratorio coltiva le cellule Vero in modo leggermente diverso; l'obiettivo è un monostrato confluente del 90-95% in ciascun pozzetto il giorno del test per il virus Zika.
- Diluire i campioni del virus Zika il giorno del test. Se i campioni di organi sono stati precedentemente omogeneizzati, prelevare i campioni dal congelatore a -80 °C e lasciarli scongelare prima di metterli in ghiaccio per il saggio.
- Sul ghiaccio, preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo aggiungendo 180 μl di terreno di coltura freddo alle file da B a H, lasciando vuota la riga A. Aggiungere 150 μl di ciascun campione di organo omogeneizzato alla riga A della piastra inferiore rotonda.
- Preparare diluizioni seriali di 10 volte di ciascun campione, utilizzando una pipetta multicanale. Diluire i campioni in una piastra rotonda a fondo rotondo a 96 pozzetti aggiungendo 20 μl di campione in 180 μl di terreno di coltura, cambiando i puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra.
- Preparare la piastra di formazione della messa a fuoco rimuovendo il terreno dalla piastra a fondo piatto a 96 pozzetti che copre le celle Vero. Fallo immediatamente prima di aggiungere i campioni di virus per evitare che il monostrato si secchi.
- Aggiungere 100 μl di diluizione del virus a ciascun pozzetto della piastra Vero. Aggiungere un campione utilizzando lo stesso set di puntali, passando dalla concentrazione più bassa a quella più alta. Placche rocciose da un lato all'altro 2-4 volte, facendo attenzione a non roteare.
- Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 1-2 ore. Assicurarsi che le piastre siano a livello all'interno dell'incubatore. Durante l'incubazione, riscaldare il 2% di metilcellulosa a RT.
- Diluire la soluzione di metilcellulosa al 2% in terreni di coltura. La diluizione deve essere in un rapporto di circa 2:1 tra metilcellulosa al 2% e terreno di coltura. Tienilo a temperatura ambiente fino al momento di usarlo. Aggiungere 1-2 gocce/pozzetto (impostare la pipetta a 125 μl) del mezzo di coltura metilcellulosa a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
- Incubare 32-40 ore a 37 °C, 5% CO2. Poiché le cellule Vero di ognuno di noi crescono in modo leggermente diverso, fattori come la confluenza cellulare e il ceppo del virus Zika possono modificare il tempo di incubazione.
- Fissare le cellule Vero utilizzando la soluzione preparata di paraformaldeide al 5%.
- Aggiungere 50 μl di paraformaldeide al 5% a ciascun pozzetto sopra lo strato di metilcellulosa nella cabina di biosicurezza. Incubare per 60 minuti a RT. Il fissaggio può avvenire per una notte a 4 °C ma coprire la lastra con parafilm per ridurre l'evaporazione.
- Scaricare la copertura e il terreno di coltura dalle cellule in un contenitore per lo smaltimento all'interno dell'armadio di biosicurezza. Lavare delicatamente con PBS, 150 μL/pozzetto. Rimuovere il PBS dalle piastre e rimuovere la piastra dal BSL-2.
- Ripetere il lavaggio PBS 2 volte aggiungendo 150 μL/pozzetto. Quindi rimuovere il PBS. Aggiungere 150 μL/pozzetto, 1x tampone di lavaggio FFA e lasciare riposare per 5-10 minuti a RT per permeabilizzare le cellule fissate.
- Rileva l'infezione utilizzando gli anticorpi Zika primari. Preparare l'anticorpo primario 4G2 (D1-4G2-4-15) a una concentrazione di 1 μg/mL in tampone di colorazione FFA. Preparare un numero sufficiente di anticorpi per l'intero test.
nota: Stai lontano dai pannolini da laboratorio o da altri materiali assorbenti ad alto contenuto di lanugine poiché le fibre avranno un impatto negativo sull'imaging dei focolai.
- Rimuovere il tampone di lavaggio FFA dalle piastre. Aggiungere 50 μl/pozzetto dell'anticorpo primario nel tampone di colorazione FFA. Sigillare le piastre con parafilm e incubare per una notte a 4 °C su una piattaforma oscillante. Il test può essere effettuato con un'incubazione per 2 ore a RT.
- Visualizzare l'infezione con l'aggiunta di un anticorpo secondario coniugato HRP. Preparare l'anticorpo secondario Goat anti-mouse HRP marcato a una concentrazione di 1:5.000 nel tampone di colorazione FFA. Preparare un numero sufficiente di anticorpi per l'intero test.
- Lavare le celle 3 volte con il tampone di lavaggio FFA, rimuovendo il tampone di lavaggio spingendolo ogni volta nel lavandino. Colorare le cellule con l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione FFA a 50 μL/pozzetto. Incubare 1-2 ore a RT.
- Lavare le celle 3 volte con il tampone di lavaggio FFA, rimuovendo il tampone di lavaggio spingendolo ogni volta nel lavandino. Aggiungere 50 μL/pozzetto del substrato Trueblue.
- Osserva attentamente le lastre, aspettando 2-15 minuti fino a quando le macchie non sono completamente definite e lo sfondo minimo. Dopo che le macchie sono visibili, lavare delicatamente con acqua, usando una mano per proteggere il monostrato dalla forza dell'acqua che scorre. Asciugare su tovaglioli di carta (NON PANNOLINI ) e scattare l'immagine il prima possibile.
- I punti possono essere contati manualmente o utilizzando un contatore di punti automatico. Se contato manualmente, un cannocchiale da dissezione può essere utilizzato per facilitare la visualizzazione.
- Per ogni campione, selezionare una diluizione con focolai facilmente distinguibili (ad esempio, da 20 a 200 per pozzetto) e calcolare il titolo in unità di formazione del fuoco per mL (FFU/ml), utilizzando la media dei pozzetti duplicati: FFU/mL = (focolai medi/pozzetti) × (fattore di diluizione) ÷ (inoculo mL).
