Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Prelievo di sangue e isolamento piastrinico
- Prelevare sangue umano da donatori adulti sani consenzienti tramite venipuntura il giorno dell'esperimento in citrato trisodico al 3,8%. Una provetta di sangue da 4,5 ml è sufficiente per produrre una quantità sufficiente di plasma ricco di piastrine (PRP) per 20-25 condizioni in donatori la cui conta piastrinica è vicina a 250 x 103 per μL.
nota: Evitare di prelevare il sangue con aghi di calibro ridotto (inferiori a 21 G).
- Preparare il PRP mediante centrifugazione a 22 °C e 140 x g per 12 minuti con una pausa lunga. Ciò si tradurrà in due strati distinti, con i globuli rossi nella parte inferiore e il PRP di colore chiaro nella parte superiore.
- Isolare lo strato superiore, torbido e giallo di PRP mediante un accurato pipettaggio attraverso un puntale di pipetta tagliato con un angolo di 45° e ottenere la conta piastrinica tramite un emocromo completo (CBC).
- Se necessario, lavare le piastrine in soluzione salina tamponata con sale sodico di acido 1,4-piperazina diethanesolfonico (PIPES) (150 mM di cloruro di sodio, NaCl, 20 mM PIPES) in presenza di prostaglandina E1 (PGE1) e risospendere nel tampone di Tyrode (134 mM di NaCl, 0,34 mM di fosfato acido disodio, Na2HPO4, 2,9 mM di cloruro di potassio, KCl, 1 mM di cloruro di magnesio, MgCl2, 5 mM di glucosio, 12 mM di bicarbonato di sodio, NaHCO3, 20 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico acido, HEPES, pH 7,35) con 5 mM di glucosio, altrimenti procedere al passaggio 1.5. I passaggi seguenti descrivono brevemente il lavaggio.
- Regolare il volume del PRP a 10 mL con soluzione salina tamponata con PIPES e aggiungere 0,6 μM di PGE1.
- Centrifugare per 8 minuti a 1.900 x g, quindi scartare il surnatante e lasciare riposare il pellet piastrinico in 400 μl di Tyrode e soluzione di glucosio per 5 minuti.
- Risospendere delicatamente il pellet piastrinico e mantenerlo indisturbato per 30 minuti.
- Regolare la conta piastrinica a ~250 x 103 piastrine per μL con plasma umano povero di piastrine (PPP) aggregato e mantenere la sospensione a 22 °C indisturbata o con una rotazione delicata.
2. Trattamento anticorpale e taglio uniforme
NOTA: Tutti i passaggi della sezione 2 che richiedono il pipettaggio devono essere eseguiti lentamente, in modo da non introdurre alcuna cesoia.
- Aggiungere l'anticorpo desiderato al PRP o alle piastrine lavate e mescolare delicatamente pipettando su e giù o mescolando con la punta di una pipetta. Lasciarlo indisturbato a temperatura ambiente per 5-10 min. Aggiungere un volume equivalente di PPP o buffer di Tyrode a un controllo negativo.
- Accendere il viscosimetro a piastra conica, impostare la temperatura della piastra a 22 °C e attendere che la piastra raggiunga questa temperatura.
- Pipettare il PRP trattato o le piastrine lavate sul viscosimetro a piastra conica a temperatura controllata direttamente al centro della piastra. Assicurarsi che tutto il campione sia depositato tra il cono e la piastra nel punto di contatto e non all'esterno del bordo del cono.
- Taglio a una velocità e durata adeguate.
- Calcolare il taglio come indicato dal manuale del viscosimetro o come mostrato in precedenza.
- Determinare la velocità di taglio dalla viscosità e dallo sforzo di taglio desiderato tramite la legge della viscosità di Newton;
; la viscosità del plasma è di 1,5-1,6 centipoise (cP). Ad esempio, un intervallo di taglio normale per la circolazione umana è 5-30 dyn/cm2 e il taglio dovrebbe essere applicato sulla scala temporale dei minuti a una cifra.
- Sollevare leggermente il cono dalla piastra (~2 mm) in modo che il campione rimanga a contatto sia con la piastra che con il cono e utilizzare un caricamento di gel o un'altra punta di pipetta lunga per raccogliere 5-10 μl dal centro del volume del campione.
- Incubare i campioni tranciati con i marcatori desiderati per 20 minuti a temperatura ambiente. Per i marcatori di fosfatidilserina, β-galattosio e P-selectina, utilizzare rispettivamente il dominio C2 della lattoferina (LactC2) a 0,08 μM, l'eritrina cristagalli lectina (ECL) a 6,25 μg/mL e l'anticorpo anti-P-selectina (20 μg/mL).
- Fissare i campioni in paraformaldeide al 2% per 20 minuti a RT prima della diluizione o della conservazione a freddo e procedere alla fase 3.1 o conservare i campioni a 4 °C per non più di 12 ore.
3. Rilevamento di marcatori di superficie e reticolazione tramite citometria a flusso
- Analizza il campione tramite citometria a flusso, raccogliendo almeno 20.000 eventi per ogni condizione.
- Quantificare la potenza del segnale dei marcatori fluorescenti utilizzando il valore di altezza per l'intensità di ciascun fluoroforo o l'intensità di fluorescenza media geometrica (MFI).
- Se si desidera rilevare la reticolazione piastrinica dopo il trattamento di taglio, analizzare il campione su un citometro a flusso compatibile con l'imaging e quantificare la reticolazione in base ai parametri di area e rapporto.
- Traccia un istogramma dell'area e/o delle proporzioni.
- Utilizzare un controllo negativo con albumina sierica bovina (BSA) o veicolo per disegnare un cancello escludendo la maggior parte degli eventi completamente circolari (questo cancello è solitamente disegnato con un rapporto di aspetto ~0,8) e quantificare la percentuale di eventi all'interno di questo cancello. Gli eventi con proporzioni inferiori hanno maggiori probabilità di essere collegati in modo incrociato.
