Valutazione del potenziale antimicrobico degli isolati batterici fecali murini produttori di batteriocina

Abstract

Fonte: Bäuerl, C., et al. Un metodo per valutare gli effetti della batteriocina sul microbiota intestinale dei topi. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video dimostra il rilevamento di batteri lattici produttori di batteriocina derivati dalla materia fecale di topo. Il test determina l'attività antimicrobica della batteriocina su specifici ceppi batterici.

Protocollo

1. Conteggio LAB e attività della batteriocina

1. Pesare un pellet fecale di ciascun campione in una provetta da 1,5 ml e aggiungere un volume adeguato di NaCl ghiacciato allo 0,9% per ottenere una soluzione al 10% (p/v). Utilizzare micro pestelli sterili per provette da 1,5 mL per omogeneizzare la sospensione fecale e preparare diluizioni seriali dieci volte in NaCl ghiacciato allo 0,9%.
2. Conta il numero totale di celle LAB.
   1. Trasferire cellule diluite (100 μL) in 4 mL di agar morbido Man Rogosa Sharpe (MRS) preriscaldato (50 °C, 0,8% agar). Mescolare a vortice prima di versare le cellule su una piastra di agar MRS solida (agar all'1,5%).
   2. Asciugare la piastra togliendo il coperchio per 5 - 10 minuti nella cappa sterile prima di incubare le cellule per 20 - 24 ore a 30 °C per la crescita cellulare e la formazione di colonie.
3. Contare le cellule produttrici di batteriocina.
   1. Trasferire le cellule diluite (100 μL) del produttore di batteriocina in 4 mL di agar morbido MRS preriscaldato (50 °C, 0,8% agar), miscelare mediante vortex e versare le cellule su una piastra di agar MRS (1,5% agar); questo strato è indicato come primo strato.
   2. Trasferire altri 4 mL di agar morbido MRS libero da cellule (0,8% di agar) sul primo strato per incorporare tutte le cellule all'interno dell'agar morbido.
      nota: Questo strato ha lo scopo di impedire alle cellule di crescere come colonie sulla superficie delle piastre di agar. Le cellule che crescono sulla superficie vengono facilmente spostate quando si versano le celle indicatrici sulla parte superiore (passaggio 4.3.4) e quindi complicano l'interpretazione dei risultati. Questo strato è indicato come secondo strato.
   3. Asciugare la piastra togliendo il coperchio per 5 - 10 minuti nella cappa sterile prima di incubare per 20 - 24 ore a 30 °C per la crescita cellulare e la formazione di colonie.
   4. Per identificare le colonie produttrici di batteriocina, mescolare 40 μL di una coltura notturna di un ceppo indicatore appropriato, con 4 mL di agar molle preriscaldato. Versare il composto sul piatto; Questo strato è indicato come il terzo strato.
   5. Asciugare la piastra togliendo il coperchio per 5 - 10 minuti nella cappa sterile prima di incubare per 20 - 24 ore a 30 °C per la crescita cellulare e la formazione di colonie.
      nota: Le colonie produttrici di batteriocina hanno zone chiare (di inibizione) intorno alle colonie (Figura 1).

Risultati

Figura 1: Rilevamento della produzione di batteriocina in LAB recuperato dalle feci mediante un protocollo a tre strati (come descritto nella procedura)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri in plastica	Termo Scientifico	101VR20
Brodo per infuso cervello-cuore	Conda	Anno 1400
Agar batteriologico europeo	Pronadisa	Anno 1800
Agarosio D1 Basso EEO	Pronadisa	8010
1x tampone TAE	Termo Scientifico	15558042
Brodo MRS	Difco	Codice 288130
Compresse PBS	sigma	P4417-100SCHEDA
scala	Mettler Toledo	PB602-S