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Articolo metodologico

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Sarkar, A., et al. La quantificazione della crescita intracellulare all'interno dei macrofagi è un metodo rapido e affidabile per valutare la virulenza dei parassiti della Leishmania. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo aver colorato in fluorescenza i nuclei dei macrofagi e del parassita.

Protocollo

1. Placcatura di BMM su vetrini coprioggetti per infezione

  1. Preparare piastre per colture tissutali a 6 pozzetti posizionando quattro (4) vetrini di vetro sterili da 12 mm (sterilizzati in autoclave e conservati in un contenitore di vetro chiuso) sul fondo di ciascun pozzetto vuoto.
    nota: Prelevare ogni vetrino coprioggetto sterile da 12 mm con una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto. Posizionare i vetrini coprioggetti nei pozzetti senza sovrapporsi, rilasciandoli nella posizione desiderata pizzicando il tubo per interrompere il vuoto.
  2. Aspirare i terreni (e le cellule non aderenti) da piast....

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Risultati

figure-results-1
Figura 1: Un'illustrazione rappresentativa dell'infezione da BMM con amastigoti axenici virulenti (A) e promastigoti in fase logaritmica non virulenti (B) di L. amazonensis. Immagini in immunofluorescenza di macrofagi isolati da topi BALB/c, 1 h e 48 h dopo l'infezione. I macrofagi infetti sono stati processati per l'immunofluorescenza come descritto nel protocollo. Le membrane PV s.......

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra per colture cellulari a 6 pozzettiStella cellulareCodice 657160
adeninaAcros OrganicsAC147440250
Puntali per pipette con barriera all'aerosol (100-1000 μL)Fisherbrand02-707-404
Puntali per pipette con barriera per aerosol (20-200 μL)Fisherbrand02-707-430
Puntali per pipette con barriera all'aerosol (2-20 μL)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Lama chirurgica in acciaio al carbonio #10Aspen ChirurgicoCodice 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL SiringaBecton Dickinson (BD)309604
Ago BD Precisionglide, 25GBecton Dickinson (BD)305124
Piatto per colture cellulari 35 mm x 10 mmStella cellulare627 160
Pallone per colture cellulariStella cellulare660175
Occhiali di copertura: cerchi da 12 mmFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)InvitrogenD1306
D-BiotinaJ.T. BakerC272-00
EdtaSigma AldrichEds
Alcool etilico a 200 gradiPharmco-AAPER111000200
Piastra Petri in polistirene non trattato TC Falcon 100 mm x 15 mmCorning351029
Siero fetale bovinoSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Microscopio a fluorescenzaNikonE200
Capra anti-topo IgG Texas rossoInvitrogenT-862
IgG anti-coniglio per capre AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LtdH0008
HEPES (1M)GibcoCodice 15630-080
Diluente Isoton IIBeckman Coulter8546719
L-GlutamminaGemelli400-106
Medio 199 (10X)GibcoCodice 11825-015
Na piruvato (100 mM)GibcoCodice 11360-070
ParaformaldeideAlfa AesarNumero 43368
Penicillina/StreptomicinaGemelli400-109
Soluzione salina tamponata con fosfato (-/-)ThermoFisher14200166
Provette da centrifuga coniche in polipropilene 15 mLStella cellulare188 271
Provette da centrifuga coniche in polipropilene 50 mLStella cellulare227 261
Reagente antisbiadimento ProLong GoldThermoFisherP36930
Anticorpo Lamp-1 anti-topo di rattoStudi sullo sviluppo Banca degli ibridomi1D4B
M-CSF umano ricombinantePeproTech300-25
Emocitometro a linea chiara ReichertHausser ScientificAnno 1492
RPMI medio 1640 (1X)GibcoCodice 11875-093
Tensioattivo Triton X-100Millipore SigmaTX1568-1
Tripan BluSigma AldrichT8154
Forbici delicate, 4 1/2"VWRCodice 82027-582
Pinze da dissezione, punta fineVWRCodice 82027-386
Vetrini per microscopioVWR16004-368
Contatore di particelle Z1 Coulter, doppia sogliaBeckman Coulter6605699

Tag

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