Un saggio di rilascio di colorante per quantificare l'attività enzimatica delle proteine antimicrobiche

Abstract

Fonte: Farris, M. H. et al., Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di antimicrobici proteici. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra il test di rilascio del colorante per quantificare l'attività enzimatica delle proteine antimicrobiche. La proteina antimicrobica degrada la parete cellulare marcata con il colorante dei batteri e rilascia le molecole di colorante trasformando la soluzione in blu. L'assorbanza della soluzione è correlata all'attività enzimatica della proteina antimicrobica.

Protocollo

1. Preparazione dei batteri

NOTA: Substrati batterici a cellule intere e peptidoglicani purificati vengono utilizzati come substrati enzimatici sia nel saggio di diffusione di microvetrini che nel test di rilascio del colorante. Questi substrati richiedono una preparazione prima di condurre le reazioni enzimatiche. Il seguente protocollo descrive la loro preparazione.

1. Substrato di cellule batteriche intere
   1. Produrre substrato cellulare batterico inoculando 500 ml di brodo nutritivo con una coltura notturna da 2 ml di Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; AT....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Micropiastra a fondo piatto a 48 pozzetti con coperchio a bassa evaporazione	Becton Dickinson	3078
Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarosio	Fisher Scientifico	BP162-100
Bacillus subtilis 168	Collezione di cultura dei tipi americani	Codice 23857
C1000 Touch Termociclatore	Bio-Rad
Standard di equivalenza McFarland (2.0)	Fisher Scientifico	Codice: R20412
Brodo nutriente	Fisher Scientifico	S25959B
Soluzione salina tamponata con fosfato (1×)	Teknova	P0200
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	Tecnologie per la vita	Codice 23227
Spettrofotometro per micropiastre Synergy HT	Strumenti BioTek, Inc.
Colorante Remazol blu brillante R (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Idrossido di sodio (NaOH)	Fisher Scientifico	S318-500
Acqua distillata ultrapura	Invitrogen	Codice 10977-015
soluzione
Brodo nutriente medio
4 g di brodo nutriente
500 ml di acqua di tipo I
Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 250mM
1 g di NaOH
99 ml di acqua di tipo I
200mM Remazol colorante blu brillante R (RBB)
1,25 g di globuli rossi
98,75 ml di soluzione di NaOH da 250 mM