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1. Preparazione dei batteri
NOTA: Substrati batterici a cellule intere e peptidoglicani purificati vengono utilizzati come substrati enzimatici sia nel saggio di diffusione di microvetrini che nel test di rilascio del colorante. Questi substrati richiedono una preparazione prima di condurre le reazioni enzimatiche. Il seguente protocollo descrive la loro preparazione.
- Substrato di cellule batteriche intere
- Produrre substrato cellulare batterico inoculando 500 ml di brodo nutritivo con una coltura notturna da 2 ml di Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubare a 30 °C con agitazione (125 rpm) fino a quando la coltura raggiunge una fase esponenziale di crescita, definita come una fase di crescita rapida con conseguente raddoppio della coltura batterica. Per la coltivazione di Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), utilizzare brodo nutriente come terreno di coltura a 37 °C con agitazione (125 giri/min).
- Uccidere a caldo ogni coltura in autoclave per 10 minuti a 121 °C a una pressione di 3 atm.
- Raccogliere il substrato batterico ucciso termicamente mediante centrifugazione per 20 minuti a 5.000 x g. Lavare il pellet tre volte con acqua di tipo 1 e rimetterlo in sospensione in una quantità minima di acqua. In questo studio, sospendere i substrati in 1.200 μl.
- Aliquotare 300 μl dei substrati cellulari batterici in provette per microfugi da 1,5 ml e conservare a 20 °C.
2. Etichettatura del substrato - Etichettatura del colorante Remazol Brilliant Blue R
NOTA: Nel saggio di rilascio del colorante, il substrato è legato in modo covalente al colorante R blu brillante Remazol. Il seguente protocollo descrive la preparazione di substrati enzimatici colorati.
- Preparare una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) da 250 mM sciogliendo 1 g di NaOH in 99 ml di acqua di Tipo I da utilizzare per preparare una soluzione di colorante R blu brillante (RBB) Remazol da 200 mM.
- Preparare una soluzione di 200 mM di RBB sciogliendo 1,25 g di RBB in 98,75 ml ± 1 ml di una soluzione fresca di NaOH da 250 mM.
- Risospendere le cellule batteriche uccise termicamente a una concentrazione di 0,5 g di peso umido in 30 ml di soluzione di RBB. Per il peptidoglicano purificato, risospendere il peptidoglicano a una concentrazione di 0,3 g di peso umido in 30 ml di soluzione di RBB.
- Incubare la miscela di reazione in un matraccio di Erlenmeyer su una piattaforma rotante per 6 ore a 37 °C mescolando delicatamente.
- Trasferire la miscela di reazione in un'incubatrice a 4 °C e incubare per altre 12 ore mescolando delicatamente.
- Dopo l'incubazione, raccogliere il substrato colorato mediante centrifugazione a 3.000 x g per 30 minuti. Decantare la soluzione colorante dal pellet del substrato.
- Rimuovere il colorante solubile non legato in modo covalente dai substrati lavando ripetutamente le cellule marcate con il colorante o il peptidoglicano (circa 3-5 lavaggi) con acqua di tipo I seguita da centrifugazione. Ad ogni aggiunta di acqua, risospendere accuratamente il pellet.
nota: Quando non legato, il colorante solubile non è più visibile nell'acqua di lavaggio dopo la centrifugazione. Il substrato deve essere lavato un ulteriore lavaggio. Si noti che il substrato rimarrà blu, mentre il surnatante dell'ultimo lavaggio sarà chiaro.
- Conservare i substrati tinti sospesi in una quantità minima di acqua a -20 °C per un uso successivo.
3. Saggio quantitativo di rilascio del colorante
NOTA: Durante il saggio di rilascio del colorante, l'idrolisi del substrato colorato con RBB nella reazione enzimatica rilascia prodotti colorati nel surnatante della reazione. La misurazione colorimetrica della quantità di colorante rilasciato indica la quantità di attività enzimatica presente all'interno del campione per un dato enzima. Il metodo quantitativo consente il confronto di diversi enzimi tra substrati e consente la variazione delle condizioni ambientali che influenzano la reazione enzimatica (ad esempio, temperatura, salinità e pH). Il seguente protocollo descrive la preparazione e l'esecuzione del saggio di rilascio del colorante per rilevare quantitativamente l'attività enzimatica degli antimicrobici proteici.
- Preparazione per il saggio di rilascio del colorante
- Lasciare che il substrato colorato congelato torni a temperatura ambiente e lavare due volte con il tampone di analisi (soluzione salina tamponata con fosfato, PBS), che è determinato empiricamente per l'enzima dato.
- Calcolare il volume di sospensione del substrato necessario moltiplicando il volume di reazione di 200 μl per il numero di saggi di rilascio del colorante da eseguire.
- Preparare la sospensione del substrato aggiungendo il substrato colorato al volume del tampone di saggio, determinato in 4.1.2, fino a raggiungere una densità ottica (OD) di 2,0 a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro. Per rimanere entro i limiti funzionali dello spettrofotometro, misurare il 2,0 OD595 come 1,0 per una diluizione 1:1 della soluzione concentrata. Utilizzare il tampone di analisi come blank.
nota: La torbidità del substrato per la reazione può essere aumentata oltre 2,0 per corrispondere ai livelli di attività di enzimi altamente efficienti.
- Sospendere la proteina antimicrobica da valutare nel tampone di saggio a una concentrazione stimata di 1 mg/ml.
- Utilizzando il test su micropiastra di un kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconninico (BCA) secondo il protocollo del produttore, determinare la concentrazione effettiva del campione proteico da analizzare. Regolare la concentrazione della sospensione madre a 1 mg/ml utilizzando il tampone di saggio.
- Utilizzo del saggio di rilascio del colorante per determinare le condizioni di incubazione ottimali per una proteina antimicrobica
- Diluire la sospensione antimicrobica proteica stock a 100 ng/μl. Questa concentrazione fornisce una massa di reazione finale di 1 μg di proteine per volume (10 μl) aggiunta alla reazione del saggio.
- Determinare l'intervallo termico da valutare per la proteina batteriolitica. L'intervallo termico in questi saggi includeva 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C e 65 °C.
- Eseguire i saggi di reazione in provette microfuge da 0,5 ml. Per ogni condizione termica, aggiungere 10 μl della proteina madre a 200 μl di sospensione del substrato preparata.
- Incubare in termociclatore per 8 ore mescolando per inversione una volta all'ora.
- Dopo l'incubazione, arrestare le reazioni aggiungendo 25 μl di etanolo.
- Rimuovere il substrato non digerito e insolubile mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 minuti e trasferire 150 μl del surnatante di reazione per ciascuna miscela di reazione in una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti, facendo attenzione a non rompere il pellet di substrato non digerito.
- Misurare l'attività enzimatica della proteina antimicrobica per un dato substrato determinando la quantità di colorante RBB solubile dissociato dal substrato dopo idrolisi enzimatica. Per quantificare l'attività enzimatica, misurare l'assorbanza del surnatante a 595 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. L'aumento dell'assorbanza da parte del colorante solubile rilasciato nel surnatante dal substrato marcato è una misura quantitativa dell'attività enzimatica.
nota: La variazione dell'assorbanza è rappresentata dalle unità di attività (AU), dove 1 UA determina un aumento di 0,01 della densità ottica del surnatante della reazione di rilascio del colorante a 595 nm. Una reazione in bianco, incubata con tutti i componenti della reazione tranne l'enzima, viene utilizzata per sottrarre qualsiasi colorante rilasciato dal substrato marcato con RBB a causa dell'incubazione. La temperatura enzimatica ottimale fornisce la misurazione dell'unità di picco di attività.