Un test su piastra spot per la valutazione delle risposte allo stress ossidativo nei ceppi batterici

Abstract

Fonte: Ketelboeter, L. M. et al., Metodi per inibire la produzione batterica di piomelanina e determinare il corrispondente aumento della sensibilità allo stress ossidativo. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra un test su piastra spot su misura per valutare le risposte allo stress ossidativo dei ceppi batterici. Alcuni ceppi producono piomelanina, un pigmento antiossidante. Al contrario, i ceppi trattati con un agente di prova, che portano a una ridotta produzione di piomelanina, mostrano una maggiore suscettibilità allo stress ossidativo, con conseguente diminuzione della vitalità cellulare rispetto ai ceppi produttori di piomelanina.

Protocollo

1. Preparazione di terreni di coltura, antibiotici e 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)

1. Preparare il brodo di Luria-Bertani (LB) (1% triptone, 0,5% estratto di lievito, 0,25% cloruro di sodio, NaCl in H₂O) e aliquotare in volumi appropriati. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
2. Preparare 100 ml di libbra di agar (1% triptone, 0,5% estratto di lievito, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H₂O) in fiasche da 250 ml. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. Assicurarsi che l'agar sia sciolto prima di versarlo nelle piastre.
   nota: I palloni contenenti 100 ml di LB agar produrranno 4 piastre. La quantità di LB agar può essere modificata in modo che corrisponda al numero di piastre necessarie per il saggio.
3. Preparare soluzione salina tamponata con fosfato, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM cloruro di potassio, KCl, 10 mM Idrogeno fosfato disodico, Na₂HPO₄, 2 mM diidrogeno fosfato di potassio, KH₂PO₄). Sterilizzare in autoclave o filtrazione e conservare a temperatura ambiente.
4. Preparare le soluzioni antibiotiche per gentamicina, kanamicina e tobramicina.
   1. Preparare le concentrazioni di antibiotici appropriate per i ceppi di Pseudomonas aeruginosa contenenti 100 mg/ml di gentamicina, 30 mg/ml di kanamicina e 10 mg/ml di tobramicina. Sciogliere gli antibiotici in acqua, filtrare sterilizzare (0,2 μm) e conservare a 4 °C. Modificare gli antibiotici e le concentrazioni a seconda del batterio studiato.

2. Saggio su piastra spot per la risposta allo stress ossidativo

1. Impostare colture notturne dei ceppi da testare. Aggiungere 2 ml di brodo LB a provette da 16 x 150 mm (una per ceppo) e inoculare con 1 colonia isolata di ciascun ceppo. Incubare per una notte a 37 °C con aerazione su un rotatore di coltura tissutale in un incubatore ad aria.
2. Misurare l'OD₆₀₀ delle colture notturne. Lavare le colture prima di eseguire le letture OD₆₀₀ per eliminare la piomelanina presente nei terreni.
3. Lavare le colture centrifugando 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 x g per 2 minuti. Rimuovere il surnatante e le eventuali cellule pellettate con un micropipettatore e risospendere il pellet di cellule solide in 1 ml di LB.
4. Il giorno successivo, preparare piastre di agar LB contenenti H₂O₂ come fattore di stress ossidativo. Un intervallo di concentrazioni di H₂O₂ da 0 a 1 mM è un buon punto di partenza.
   1. Sciogliere i palloni di agar LB. Raffreddare il fluido a circa 50 °C a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere H₂O₂ direttamente al fluido raffreddato alle concentrazioni desiderate. Agitare i palloni per mescolare. Vedere la Tabella 1 per le concentrazioni di H₂O₂ e i volumi di H₂O₂ concentrati da aggiungere. Questi valori si basano su 100 ml di agar LB.
   3. Versare le piastre subito dopo aver aggiunto H₂O₂ e fiammare la superficie per eliminare le bolle. La resa è di 4 piastre per 100 ml di agar LB. Segnare le targhe con la concentrazione di H₂O₂.
   4. Posizionare le piastre scoperte in una cappa a flusso biologico con la ventola in funzione per 30 minuti per rimuovere l'umidità in eccesso dalle piastre.
      nota: Utilizzare i piatti lo stesso giorno in cui vengono preparati. In caso contrario, i dati potrebbero essere incoerenti.
      nota: In questo saggio, i fattori di stress ossidativo come il paraquat possono essere sostituiti con H₂O₂. Le concentrazioni utilizzate per altri fattori di stress ossidativo possono essere diverse da quelle utilizzate per H₂O₂.
5. Lavare e misurare l'OD₆₀₀ delle colture notturne.
6. Normalizzare l'OD₆₀₀ di tutte le colture notturne al valore più basso per l'insieme di ceppi in esame. P. aeruginosa ha generalmente un OD₆₀₀ di circa 2,5 quando viene coltivato durante la notte in LB.
   1. Determinare il volume di coltura necessario per diluire la coltura al diametro esterno più basso di₆₀₀ in un volume totale di 1 ml. Ad esempio, se una coltura ha un OD₆₀₀ di 3 e il OD₆₀₀ più basso per l'insieme di ceppi è 2,5, eseguire il seguente calcolo: (2,5)(1 ml) = (3)(x). x = 0,833 ml. 0,833 ml di coltura saranno posti in una provetta per microfuge.
   2. Calcolare la quantità di LB + DMSO necessaria per portare il volume di coltura a 1 ml. Per l'esempio del passaggio 4.4.1, la quantità di LB + DMSO aggiunta alla coltura sarebbe 0,167 ml (1 ml di volume totale – 0,833 ml di coltura). Prepara soluzioni stock di LB + DMSO da utilizzare per queste diluizioni in base al volume necessario per diluire tutti i ceppi.
   3. Mescola la cultura e LB + DMSO con il vortex.
7. Per mantenere le colture in una concentrazione costante di DMSO, eseguire diluizioni seriali di dieci volte delle colture notturne normalizzate in PBS + DMSO.
   1. Crea una soluzione stock di PBS + DMSO. Per una serie di diluizioni per un ceppo, mescolare 300 μM di volume di DMSO con PBS per ottenere un volume totale di 720 μl. Aumenta o diminuisci queste scorte a seconda del numero di ceppi testati.
   2. Etichettare le provette per microfugi per diluizioni seriali da ^10-1 a ^10-7. Aggiungere 90 μl di PBS + DMSO alle provette appropriate. Usa PBS + DMSO per le varietà coltivate in LB + DMSO.
   3. Aggiungere 10 μl di coltura nell'appropriata provetta di diluizione ^10-1. Miscelare mediante vortex e trasferire 10 μl della diluizione ^10-1 nella provetta di diluizione ^10-2. Ripetere fino a quando tutte le diluizioni sono state eseguite. Sostituire i puntali delle pipette tra una diluizione e l'altra.
8. Individuare 5 μl delle diluizioni da ^10-3 a ^10-7 su piastre LB + H₂O₂ in duplicato per ciascun ceppo. Utilizzare un puntale della pipetta se le macchie sono piastrate dal più diluito al meno diluito (da ^10-7 a ^10-3). Non inclinare o inclinare la piastra finché il liquido non si è asciugato nella piastra.
9. Incubare le piastre per 24-48 ore a 37 °C (incubatore ad aria), a seconda del ceppo.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 avrà colonie di buone dimensioni su LB dopo 24 ore di incubazione. Incuba i ceppi fino a quando non hanno colonie approssimativamente delle stesse dimensioni di PAO1.
10. Fotografare le lastre utilizzando una camera CCD sopra un transluminatore. Facoltativamente, modifica le foto per il contrasto e ritagliale alla stessa dimensione. Conta il numero di colonie in ogni punto per determinare i cambiamenti nella sensibilità allo stress ossidativo.

Tabella 1: Concentrazioni di H₂O₂ da aggiungere all'agar LB per il saggio spot plate da stress ossidativo. Questa tabella fornisce varie concentrazioni di H₂O₂ e la corrispondente quantità di stock concentrato di H₂O₂ da aggiungere a 100 ml di agar LB.

Concentrazione finale di H2O2 (mM)	Quantità di 9,79 M H2O2 (30% in peso) da aggiungere (μl)
0	0
0,2	2.04
0,4	4.09
0,6	6.13
0,8	8.17
1	10.21

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50 mg	Chiamato anche nitisinone. Solubile in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30% in peso di H2O. Stabilizzato.