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1. Ceppo batterico e terreno di crescita
- Preparare la soluzione madre di albumina, destrosio e sale (ADS) solubilizzando 25 g di albumina sierica bovina, 10,0 g di destrosio e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Sterilizzare con filtro l'ADS e conservarlo a 4 °C.
- Prepara il brodo 7H9 aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 ml di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Sterilizzare in autoclave il brodo 7H9 a 121 °C per 10 min e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Preparare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 °C.
- Pesare 50 mg di kanamicina solfato e scioglierlo in 1 mL di acqua deionizzata; la concentrazione finale è di 50 mg/mL. Filtrare-sterilizzare e conservare a -20 °C. Aggiungere 0,5 mL di soluzione madre di kanamicina per 1 L di 7H9ADST.
nota: Questo terreno deve essere preparato fresco, quindi ridimensionare i volumi in modo appropriato in base alle dimensioni della coltura.
- Coltiva M. tuberculosis in 7H9ADST integrato con kanamicina in coltura in piedi. Agitare quotidianamente la coltura e diluirla prima che l'OD600 raggiunga 1,0 per evitare la formazione di grumi.
nota: Il ceppo di M. tuberculosis utilizzato per lo sviluppo di questo metodo è stato H37Rv trasformato con plasmide pJAK2.A. pJAK2.A è un plasmide integrativo basato sul vettore pMV361, che consente l'espressione ad alto livello del gene della luciferasi della lucciola dal promotore hsp60 e può essere selezionato utilizzando la kanamicina.
2. Analisi dell'attività in brodo utilizzando un test di Resazurina
- Coltivare M. tuberculosis in 7H9ADST fino alla fase di log medio (~ 0,5 - 0,8 OD600). Diluire la coltura con il 7H9ADST a 0,01 OD600. Diluire i composti in 7H9ADST a 2 volte le concentrazioni di prova e aliquotare 100 μL di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto.
- Trasferire 100 μl della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Lasciare incubare le piastre a 37 °C in un'incubatrice umidificata per 5 giorni. Sciogliere 10 mg di resazurina in 100 mL di acqua deionizzata e un filtro sterile.
- Aggiungere 30 μL di soluzione di resazurina e monitorare il cambiamento di colore dopo 48 ore; la crescita batterica è indicata da una conversione del colore dal blu al rosa.
nota: Un'analisi quantitativa può essere eseguita anche misurando la fluorescenza a 590 nm con eccitazione a 530 - 560 nm o l'assorbanza a 570 nm e 600 nm.