Misurazione del TEER in cellule epiteliali irradiate con raggi X in co-coltura con PBMC

Abstract

Fonte: Babini, G., et al. Un metodo di co-coltura per studiare il crosstalk tra le cellule Caco-2 irradiate con raggi X e PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale nelle cellule Caco-2 irradiate, sia in presenza che in assenza di cellule PBMC. Questo metodo consente lo studio degli effetti sinergici delle radiazioni e delle cellule immunitarie sulla barriera cellulare epiteliale.

Protocollo

1. Impostazione dell'irradiazione

Nota: L'irradiazione delle cellule Caco-2 è stata eseguita presso il reparto di radioterapia dell'Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italia) con un acceleratore lineare utilizzato di routine per trattare diversi tipi di cancro.

1. Impostare l'energia dei raggi X dei fotoni a 6 MV di picco. L'acceleratore lineare opera in regime pulsante (tempo tra due impulsi consecutivi di circa 4 ms; durata di un singolo impulso di circa 5 μs con una dose fino a 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Posizionare le piastre a 6 pozzetti contenenti inserti con Caco-2 sulla traiettoria dei raggi X su una lastra di plexiglas di 1,4 cm di spessore (corrispondente a una distanza leggermente maggiore dell'accumulo della radiazione utilizzata) a 100 cm dalla sorgente di radiazione.
3. Posizionare un bolo di 0,5 cm di spessore su ciascun campione prima che avvenga l'irradiazione per garantire la componente di radiazione retrodiffusa e l'equilibrio delle particelle cariche.
4. Irradiare le cellule (dosi nell'intervallo 2 - 10 Gy) con un campo di radiazione piatto e simmetrico (± 2%) di 20 x 20 cm₂ e un rateo di dose di 3 Gy/min.
   nota: Le cellule irradiate con "sham" di controllo sono state sottoposte alle stesse condizioni procedurali di quelle irradiate, senza entrare nella camera di irradiazione (dose ricevuta: 0 Gy).
   cautela: I dispositivi che producono radiazioni ionizzanti devono essere utilizzati solo da personale specializzato.

2. Resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

1. Seminare 5 × 10⁵ cellule Caco-2 una settimana prima dell'irradiazione in inserti di co-coltura su piastra a 6 pozzetti (polietilene tereftalato (PET), 2 x 10⁶ pori/cm2).
2. 1 ora prima dell'irradiazione, misurare il TEER con un voltmetro/ohmmetro.
3. Irradiare le celle come descritto nei passaggi 1.1 - 1.4.
4. Incubare le cellule Caco-2 in presenza/assenza di co-coltura con PBMC a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
5. Per le prime ore dopo l'irradiazione, misurare il TEER ogni ora e successivamente ogni 3 ore fino a 48 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inserti per colture cellulari a 6 pozzetti ThinCert per piastre multipozzetto	Greiner Bio-one	Codice 657610	attrezzatura
Piastra multipozzetto per colture cellulari, 6 pozzetti	Greiner Bio-one	Codice 657160	plastico
Piastra multipozzetto per colture cellulari, 24 pozzetti	Greiner Bio-one	Codice 662160	plastico
RPMI 1640 senza L-Glutammina	Lonza	12-167F	Reagenti
Millicell-ERS voltmetro/ohmetro	Millipore	MERS 00001	attrezzatura