1. Iniziazione del Biofilm
- Coltiva una coltura di organismi produttori di biofilm in un terreno ricco di sostanze nutritive. Inoculare lo Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da un stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che comportano la manipolazione di S. aureus con i guanti e all'interno di una cabina di biosicurezza.
- Incubare per 16 ore a 37 °C su agitatore rotante (100-200 giri/min).
- Determinare OD600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro e una cuvetta standard (lunghezza del percorso: 1 cm).
- Calcolare il volume (V) di coltura necessario per preparare 20 ml di inoculo con OD600 (inoculo) di 0,1 in terreno chelexed del Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) utilizzando la formula: [V = 20 ml*0,1/OD600 (coltura)].
- Aggiungere il volume di coltura calcolato (dall'alto) a una provetta da centrifuga e alle celle in pellet centrifugando per 1 minuto a 10.000 x g. Per preparare l'inoculo del biofilm, aspirare il terreno di coltura esaurito e risospendere il pellet cellulare in 20 ml di CRPMI.
- Versare l'inoculo in un serbatoio da 25 ml.
- Rimuovere con cautela il coperchio da una piastra sterile a 96 pozzetti tirandola verso l'alto.
NOTA: Prestare attenzione a non contaminare i pioli che pendono dal coperchio. Il coperchio può essere posizionato capovolto su una superficie pulita all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Utilizzando una pipetta multicanale da 200 μl, aggiungere 125 μl di inoculo a ciascun pozzetto delle file da A a G della piastra inferiore.
- Riempire 125 μl di terreno sterile CRPMI in ciascun pozzetto della fila H per il controllo della sterilità.
- Prendi il coperchio del piolo e tienilo sopra il fondo del piatto con i pioli rivolti verso il basso. Allineare con cura i singoli pioli con i rispettivi pozzetti. Evitare il contatto fisico tra la piastra e i pioli. Una volta allineato, abbassare con cautela il coperchio. Evitare disallineamenti poiché le regolazioni eseguite dopo che i pioli hanno toccato la piastra inferiore possono contaminare i controlli di sterilità nella fila H.
- Sigillare il coperchio della piastra con una pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e metterlo in un sacchetto di plastica sigillabile, sigillandolo ermeticamente. Mantenere il volume d'aria nel sacchetto il più basso possibile per ridurre al minimo l'evaporazione.
- Incubare senza agitare a 37 °C per 48 ore in un incubatore al 5% di CO2.
Nota: 48 ore di crescita sono state ottimali per S. aureus, ma varieranno in base all'organismo utilizzato.
nota: Sebbene l'incubazione statica sia un buon punto di partenza per ottimizzare il saggio, agitare delicatamente a 150 giri/min su un agitatore per micropiastre è una possibile variazione che può migliorare la formazione del biofilm di alcuni isolati di S. aureus.
2. Preparazione della Challenge Plate Biofilm
- Il giorno della sfida del biofilm prelevare una nuova piastra da 96 pozzetti e aggiungere 100 μl di CRPMI, bilanciato a RT, a ciascun pozzetto delle file da B a H. Per evitare risultati incoerenti, utilizzare una piastra a 96 pozzetti in grado di contenere 200 μl di terreno quando i pioli sono all'interno e dotata di pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra di inizio del biofilm.
- Diluire separatamente fino a 4 composti in esame in 1,0 ml di CRPMI a 2 volte la concentrazione finale desiderata, in modo da tenere conto di una diluizione finale al punto 2.7.
Nota: un buon punto di partenza è 8 volte superiore alla concentrazione inibitoria delle cellule planctoniche.
- Aggiungere 200 μl di composto 1 nei pozzetti da A1 ad A3, il composto 2 nei pozzetti da A4 ad A6, il composto 3 nei pozzetti da A7 ad A9 e il composto 4 nei pozzetti da A10 ad A12.
- Diluire in serie i composti in esame utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 100 μl dalla fila A alla riga B e mescolare.
- In questo modo, continuare a trasferire 100 μl da pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e fermarsi nella fila F.
- Dopo la miscelazione, espellere 100 μl dalla fila F in un contenitore di scarto. Non trasferire alcun liquido nelle file G e H.
- Aggiungere 100 μl di CRPMI a ciascun pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale per portare il volume a 200 μl. Vedere la Figura 1 per il layout finale della targa.
3. Sfida del biofilm
- Aggiungere 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una piastra sterile a 96 pozzetti fresca dotata di pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra di inizio del biofilm.
- Rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola di paraffina dalla piastra di inizio del biofilm incubata.
- Solleva il coperchio verso l'alto. Evitare il contatto tra i pioli e il fondo della piastra in quanto ciò potrebbe danneggiare il biofilm. Conservare la parte inferiore per la successiva analisi OD600 (vedere 3.8).
- Sciacquare le cellule planctoniche posizionando il coperchio del piolo sulla piastra contenente PBS (dal passaggio 3.1). Immergi i pioli per 5 secondi, sollevali dal PBS e immergili ancora una volta, facendo attenzione a non sbattere i pioli contro i lati del pozzo.
- Posizionare il coperchio del piolo risciacquato nella piastra di sfida. Evitare il contatto non necessario tra i pioli e la piastra inferiore in quanto ciò danneggerebbe il biofilm portando a risultati incoerenti.
- Sigillare la piastra con un film di paraffina e inserirla in un sacchetto di plastica sigillabile come descritto al punto 1.10.
- Incubare la piastra senza agitare per 24 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2
.
- Prendere il fondo della piastra di inizio del biofilm da 3.3. Risospendere i batteri in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e misurare l'OD600 con un lettore di micropiastre adatto per confermare la crescita che si verifica in tutti i pozzetti, ad eccezione dei controlli di sterilità nella riga H.
4. Determinazione del biofilm
- Utilizzare un lettore di piastre dotato di una camera di incubazione e in grado di effettuare letture di fluorescenza cinetica per rilevare la conversione della resazurina. Imposta una misurazione della fluorescenza cinetica 24 ore su 24 utilizzando un'eccitazione di 530 nm e un'emissione di 590 nm.
- Impostare la temperatura della camera a 37 °C e far leggere la piastra ogni 20 minuti. Impostare il lettore di piastre in modo che misuri dal fondo della piastra secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare la piastra di lavaggio aggiungendo 200 μl di PBS con una pipetta multicanale a una piastra sterile a 96 pozzetti.
- Preparare il terreno di recupero del biofilm aggiungendo 400 μl di soluzione madre di resazurina 0,8 mg/ml a 20 ml di terreno CRPMI fino a una concentrazione finale di 16 μg/ml di resazurina.
nota: La resazurina è un noto irritante per la pelle. Utilizzare un camice da laboratorio, occhiali antispruzzo e guanti durante la manipolazione. Il CRPMI come mezzo di recupero del biofilm è stato utilizzato perché fornisce il segnale di fondo più basso, ma può essere sostituito da un terreno Mueller Hinton se appropriato.
- Aggiungere 150 μl di terreno di recupero del biofilm con una pipetta multicanale a ciascun pozzetto di una piastra fresca da 96 pozzetti.
- Trasferire la piastra di sfida dall'incubatrice in una cabina di biosicurezza e rimuovere con cura il sacchetto di plastica e la pellicola sigillante.
- Rimuovere il coperchio del piolo dalla piastra di sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come descritto in 3.4. Conservare la parte inferiore della piastra di sfida per la successiva analisi OD600 (vedere 4.10).
- Dopo il risciacquo, posizionare il coperchio del piolo sul fondo della piastra contenente il mezzo di recupero del biofilm.
- Avvolgere il lato della piastra con pellicola di paraffina, facendo attenzione a non ostruire il fondo dei pozzetti perimetrali. Subito dopo aver avvolto la piastra, posizionarla sul lettore di piastre e iniziare una lettura cinetica nell'arco di 24 ore avviando il protocollo cinetico di resazurina precedentemente realizzato dal passaggio 4.1.
- Per quantificare la crescita delle cellule planctoniche che può verificarsi o meno durante la sfida, leggere l'OD600 dell'intero fondo della piastra di sfida utilizzando un lettore di micropiastre. Seguire le istruzioni fornite al punto 3.8.
Nota: Risospendere con cura il contenuto di ciascun pozzetto poiché le cellule che si staccano dal biofilm tendono a crescere in grumi sul fondo del pozzetto. Eventuali bolle all'interno del pozzetto interferiranno fortemente con le letture di OD600 e devono essere evitate o rimosse prima della lettura.
