1. Preparazione
- Placcatura Celle
nota: In questo protocollo sono state utilizzate cellule epiteliali cervicali umane, HeLa e HeLa che esprimono l'istone 2B-GFP (H2B-GFP), ma questo test può essere adattato ad altre cellule di mammifero.
- Staccare le cellule aderenti da un pallone di coltura cellulareda 75 cm 2 lavando le cellule con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Sostituire la tripsina usata con 2 mL di tripsina-EDTA fresca allo 0,25%.
- Incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti fino a quando le cellule non si sono arrotondate e staccate dal pallone.
- Risospendere le cellule in 8 mL di terreno di crescita (DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina).
- Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e 10 μL di sospensione cellulare.
- Diluire le cellule in un mezzo di crescita a una concentrazione di 2,5 x 105 cellule/mL.
- Versare la sospensione cellulare in una bacinella per pipette sterile e miscelare accuratamente la sospensione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
- Utilizzando una micropipetta multicanale da 12 e puntali da 200 μl, distribuire le cellule HeLa (2,5 x 104 cellule/100 μl/pozzetto) in triplicato (o quadruplicato) in una piastra piatta a 96 pozzetti, a fondo chiaro, trattata con coltura di tessuto in polistirene nero.
nota: Una disposizione di placcatura è presentata come esempio nella Figura 1.
- Coltura delle cellule per 24 ore in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
- Preparazione della soluzione madre
- Preparare 1 litro di una scorta 10x di tampone M (utilizzato per preparare M1 e M2) aggiungendo 95 g di soluzione salina bilanciata Hanks, 0,476 g di MgCl2 (5 mM) e 23,83 g di HEPES (100 mM) a 900 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4 e aumentare il volume a 1 L. Filtro sterilizzare.
- Preparare 50 ml di una scorta di glucosio 50x (1,25 M) aggiungendo 11,26 g di D-(+)-glucosio a un totale di 50 ml di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
- Preparare 50 ml di una scorta di calcio 100x (120 mM) aggiungendo 0,666 g di CaCl2 a un totale di 50 ml di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
- Preparare 50 mL di una scorta 10x (50 mM) di acido etilenglicol-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N', tetraacetico (EGTA) aggiungendo 0,951 g di EGTA a 40 mL di acqua. Aumentare il pH a 8 utilizzando NaOH per sciogliere l'EGTA, quindi aumentare il volume a 50 ml. Filtro sterilizzare la soluzione.
- Per una singola piastra da 96 pozzetti, preparare 50 mL di Terreno 1 (M1, contiene Ca2+), 50 mL di Terreno 2 (M2, Ca2+-free) e 15 mL di Medium 2 integrati con EGTA, di conseguenza:
- Per M1, aggiungere 5 ml di tampone 10x M, 0,5 ml di 100x CaCl2 e 1 ml di glucosio 50x a 43,5 ml di acqua.
- Per M2, aggiungere 5 ml di tampone M 10x e 1 ml di glucosio 50x a 44 ml di acqua.
- Per M2/EGTA, aggiungere 1,5 mL di 10x Buffer M e 1,5 mL di 10x EGTA a 12 mL di acqua.
nota: Tutte le soluzioni contenenti ioduro di propidio (PI) devono essere preparate direttamente prima di essere aggiunte alle cellule.
- Impostazioni del lettore di piastre/citometro per immagini
nota: Utilizzare un lettore di piastre multimodale dotato di due unità di rilevamento: uno spettrofluorimetro e un citometro per immagini. Limitare l'esposizione alla fluorescenza per evitare il fotosbiancamento dei fluorofori.
- Preriscaldare il lettore di piastre a 37 °C prima di eseguire il saggio.
- Impostare i parametri per il saggio cinetico di conseguenza nella modalità Impostazioni:
- Scegli Monocromatore, FL (fluorescenza) e Cinetico rispettivamente per la configurazione ottica, le modalità di lettura e il tipo di lettura.
- In Impostazioni lunghezza d'onda, selezionare rispettivamente una banda passante di eccitazione ed emissione di 9 e 15 nm. Per i saggi che utilizzano ioduro di propidio (PI), impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 535 e 617 nm.
- In Tipo di piastra, selezionare 96 pozzetti per il formato della piastra e una configurazione di piastra preimpostata corrispondente a una piastra inferiore trasparente a parete nera.
- In Area di lettura, evidenziare i pozzetti che verranno analizzati durante la cinetica.
- In PMT e ottica, preimpostare i flash per lettura su 6 e selezionare la casella per Leggi dal basso.
- In Temporizzazione, inserire 00:30:00 nella casella Tempo di esecuzione totale per un test cinetico di 30 minuti e inserire 00:05:00 per Interval.
Nota: per ogni punto temporale e una lunghezza d'onda, il tempo di lettura di una piastra completa a 96 pozzetti è di 30 s.
- Confermare le impostazioni specificate nelle informazioni sulle impostazioni a destra e selezionare OK. Premere Leggi per avviare la corsa cinetica.
- Impostare i parametri di imaging di conseguenza nella modalità Impostazioni:
- Scegliere Minimax, Imaging ed Endpoint rispettivamente per la configurazione ottica, le modalità di lettura e il tipo di lettura.
- In Lunghezze d'onda, selezionare la luce trasmessa e una o entrambe le caselle di fluorescenza corrispondenti alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 456/541 nm (GFP) e 625/713 nm (PI).
- Utilizzare le stesse opzioni per il Tipo di Piastra e l'Area di Lettura come definito nei passaggi 1.3.2.3 e 1.3.2.4.
- In Impostazione area pozzetto, selezionare il numero di siti all'interno di un pozzo da riprodurre.
Nota: 12 siti corrispondono a un'immagine a pozzetto intero.
- Nelle impostazioni di acquisizione dell'immagine, selezionare i tempi di esposizione per la luce trasmessa, 541 (GFP) e 713 (PI). Per la GFP, acquisire un'immagine dell'intero pozzetto con un tempo di esposizione di 20 ms/immagine. Per la luce trasmessa (TL) e la fluorescenza PI, acquisire una singola immagine del centro di ciascun pozzetto con tempi di esposizione rispettivamente di 8 e 20 ms.
- Confermare le impostazioni specificate nelle informazioni sulle impostazioni a destra e selezionare OK. Il tempo di acquisizione per l'imaging dell'intera superficie di ciascun pozzetto (12 immagini/pozzetto) di una piastra a 96 pozzetti e per una lunghezza d'onda è di ~15 min. Premere Read per avviare l'imaging imaging.
Nota: Il tempo di acquisizione di una singola immagine/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti richiede ~2,5 min/piastra per una lunghezza d'onda. I parametri sopra descritti corrispondono alle attrezzature specifiche del nostro laboratorio. Misure spettrofluorimetriche: una lampada flash allo xeno che visualizza lunghezze d'onda di eccitazione con incrementi di 1,0 nm (250-850 nm) con una banda passante regolabile di 9 o 15 nm, un rivelatore a tubo fotomoltiplicatore con una gamma dinamica di > 6 log e una banda passante di emissione regolabile a 15 o 25 nm. Citometro per immagini: una sorgente luminosa di illuminazione in grado di emettere luce bianca, lunghezze d'onda di eccitazione di 460 nm e 625 nm con una banda passante di 20 nm, filtri di emissione centrati rispettivamente a 541 nm (108 nm di banda) e 713 nm (123 nm di banda passante) e un obiettivo 4X accoppiato a una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a 12 bit da 1,25 megapixel.
2. Saggio
Nota: Al momento del test, le cellule devono essere confluenti al 70-90%. Durante le fasi di lavaggio, il terreno deve essere rimosso e applicato sulla parete laterale del pozzetto (non direttamente sopra le celle). Mantenere la temperatura di LLO a < 4 °C per prevenirne l'aggregazione fino al passaggio 3.1.5.
- Preparare uno stock di 30 μM PI in M1 e uno stock di 30 μM PI in M2 preriscaldato a 37 °C.
- Lavare delicatamente le cellule nella piastra 1 utilizzando una micropipetta multicanale da 12 e puntali da 200 μl, come segue:
- Per le condizioni di riparazione, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con 200 μL/pozzetto M1 preriscaldato a 37 °C. Sostituire il terreno con 100 μL/pozzetto di M1 caldo contenente 30 μM di PI.
- Per condizioni restrittive di riparazione, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con 200 μL/pozzetto di M2 caldo contenente 5 mM di EGTA per chelare il Ca2+, seguito da un lavaggio con 200 μL/pozzetto M2. Sostituire il mezzo con 100 μL/M2 ben caldo contenente 30 μM PI.
- Dopo che il terreno di coltura è stato lavato e sostituito con un terreno contenente ioduro di propidio, passare direttamente al passaggio 2.1.3.
- Piastra di imaging 1 in luce trasmessa, GFP e PI come descritto in 1.3.3 (precinetica). Questo passaggio dura 15-20 minuti.
- Durante il periodo di 15 minuti del passaggio 2.1.3, preparare la piastra 2 utilizzando una micropipetta multicanale da 12 e puntali da 200 μl come segue:
- Posizionare una micropiastra in polipropilene a fondo tondo a 96 pozzetti sul ghiaccio. Configurare la piastra utilizzando un progetto sperimentale corrispondente alla piastra 1 (Figura 1).
- Per le condizioni permissive alla riparazione, aggiungere 100 μL/pozzetto di M1 ghiacciato contenente 60 μM PI, seguito dall'aggiunta di 100 μL/pozzetto di M1 ghiacciato contenente 4x LLO o meno per il controllo.
- Per condizioni restrittive della riparazione, aggiungere 100 μL/pozzetto di M2 ghiacciato contenente 60 μM PI, seguito dall'aggiunta di 100 μL/pozzetto di M2 ghiacciato contenente 4x LLO o meno per il controllo.
- Dopo aver immagino la lastra 1 (passaggio 2.1.3), posizionarla immediatamente sul ghiaccio, utilizzando un foglio di alluminio per separare la lastra dal contatto diretto con il ghiaccio. Lasciare raffreddare la piastra 1 per 5 minuti.
- Utilizzando una micropipetta multicanale da 12 μl e puntali da 200 μl, trasferire 100 μl da ciascun pozzetto nella piastra 2 (passaggio 2.1.4) nei pozzetti corrispondenti nella piastra 1. Per distribuire correttamente la tossina nel terreno della piastra 1, inserire le punte sotto il menisco ed espellere delicatamente il volume senza introdurre bolle.
Nota: Non pipettare su e giù, poiché ciò potrebbe inavvertitamente staccare le cellule.
- Lasciare la piastra per un altro 1 minuto per consentire alla tossina di legarsi alle cellule e trasferire immediatamente la piastra 1 al lettore di piastre per il saggio cinetico utilizzando la modalità spettrofluorimetro (passaggio 1.3.2).
- Al termine del saggio cinetico, acquisire immediatamente l'immagine della piastra 1 (post-cinetica) utilizzando il passaggio 1.3.3.
3. Analisi: Enumerazione delle celle
- Determinare la conta cellulare in base alla fluorescenza nucleare utilizzando il software di enumerazione delle cellule per micropiastre.
- In Impostazioni, selezionare Rianalisi e nella sezione della categoria all'interno delle Impostazioni di analisi delle immagini selezionare Analisi discreta degli oggetti utilizzando 541 come lunghezza d'onda per la ricerca degli oggetti.
- All'interno dell'opzione Trova oggetti, utilizzando il metodo di ricerca Disegna su immagini, seleziona Nuclei nella scheda delle impostazioni e premi Applica.
- Premere OK e Leggi per avviare l'algoritmo di conteggio delle celle.
