Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Fissazione in formalina dei tessuti
- Posizionare i tessuti cerebrali di 3-5 mm raccolti dopo l'autopsia in una soluzione di formalina tamponata con fosfato al 10% (rapporto tessuto/formalina da 1:20 a 1:50) per 24-72 h.
cautela: La formalina è un fissativo tossico.
- Registrare il peso approssimativo del tessuto (dimensioni), il tipo di tessuto (aree cerebrali) e il volume della formalina. È importante che i laboratori documentino e conservino registrazioni sui tempi di fissazione.
- Per una conservazione più lunga dei tessuti dopo la fissazione della formalina e prima della lavorazione, immergere il tessuto in etanolo al 70%.
2. Lavorazione dei tessuti
- Dopo la fissazione del campione, sezionare il tessuto per includere le aree cerebrali importanti, ad esempio le sezioni trasversali del tronco encefalico, del cervelletto (3 lobi) o dell'ippocampo (entrambi gli ippocampi) ciascuno tagliato da 3 a 5 mm di spessore e inserito in cassette di lavorazione.
- Processare le cassette di tessuto per l'infiltrazione di cera di paraffina, incorporate in blocchi di paraffina e sezionate (da 3 a 6 μm) su un microtomo.
3. Preparazione dei materiali / Colorazione dei piatti
- Preparare la piastra di colorazione (Tabella dei materiali) come mostrato nella Figura 1. Riempire ogni piatto con 250 ml di soluzione.
- Preparazione della soluzione madre del substrato 3-ammino-9-etilcarbbizolo (AEC)
- Sciogliere una compressa da 20 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) in 5 mL di N,N, dimetilformammide utilizzando una pipetta di vetro.
cautela: L'AEC è un agente cancerogeno.
- Preparazione della soluzione madre di proteasi (ad es. pronasi) per il recupero dell'antigene
- Sciogliere 7 mg di proteasi in 200 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Preparazione del tampone di risciacquo PBS-T
- Aggiungere 10 ml di Tween da 80 a 990 ml di PBS. Mescolate bene fino a formare una soluzione omogenea.
4. Deparaffinazione e reidratazione dei tessuti
- Realizzare una sezione di paraffina di 5 μm utilizzando un microtomo, farla galleggiare a bagnomaria a 38 °C e raccoglierla su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna/pennarello resistente ai reagenti.
- Disporre i vetrini su una teglia e scioglierli in forno a 55-60 °C per 1 ora. Non aumentare la temperatura oltre i 60 °C in quanto può distruggere l'antigene virale.
- Togliere i vetrini dal forno e deparaffinare immediatamente in 3 risciacqui consecutivi con xilene di 5 minuti ciascuno nei piatti 1, 2 e 3.
- Reidratare le sezioni sul vetrino mediante immersioni sequenziali in diluizione decrescente di etanolo in acqua deionizzata: (da 4 a 11 è un risciacquo per immersione) piatto 4: xilene/100% etanolo (1:1); piatto 5: 100% etanolo; piatto 6: 100% etanolo; piatto 7: 95% etanolo; piatto 8: 95% etanolo; piatto 9: 80% etanolo; piatto 10: 70% etanolo; piatto 11: acqua deionizzata (Figura 1. Allestimento della parabola).
cautela: Lo xilene è una sostanza chimica pericolosa e il lavoro deve essere svolto in una cappa aspirante.
5. Recupero dell'antigene proteolitico
- Trattare i vetrini con la proteasi (2,5 μg/mL di PBS) per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico nella piastra 12.
- Quindi risciacquare in PBS-T per 10 minuti (piatto 13).
- Trattare con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti (piatto 14).
- Anche in questo caso, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 15).
6. Procedura di colorazione
- Maneggiare le diapositive una alla volta mantenendo le diapositive rimanenti immerse nel buffer (non rimuovere l'intero supporto per diapositive - mantenere le diapositive bagnate). Rimuovere un vetrino e tamponare il tampone in eccesso (usando un tovagliolo di carta) intorno alla sezione di tessuto, facendo attenzione a non disturbare la sezione di tessuto. Incubare i vetrini in una camera di umidità, realizzata posizionando tovaglioli di carta inumiditi, sul banco di lavoro del laboratorio a temperatura ambiente con normale siero di capra (bloccante) per 15 minuti.
- Incubare con l'anticorpo primario antirabbico di diluizione ottimale predeterminata (diluizione 1:250 del siero antirabbico di topo, non pubblicato) (controllo positivo) e con anticorpi di controllo negativi a temperatura ambiente come sopra (passaggio 6.1.) per 60 minuti senza lavaggi intermedi.
- Dopo 60 minuti, lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con l'anticorpo biotinilato (specie-specifico) in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (trattamento come al punto 6.1).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con il complesso streptavidina-perossidasi di rafano (HRP) in una camera di umidità a temperatura ambiente per 15 minuti (trattamento uguale a 6,1.).
- Lavare con PBS-T per 10 minuti (piatto 16).
- Incubare con substrato di perossidasi, ammino-etilcarbazolo (AEC), in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Eseguire l'AEC appena prima dell'uso. A tale scopo, aggiungere 1 mL di soluzione madre AEC a 14 mL di tampone acetato 0,1M, pH 5,2. Aggiungere 0,15 mL di perossido al 3%, H2O2. Filtrare la miscela appena prima dell'uso (filtro da 0,45 μm).
nota: La soluzione di lavoro di AEC è stabile solo per 2-3 ore. La soluzione madre AEC può essere conservata in frigorifero per periodi più lunghi.
- Lavare in acqua deionizzata per 10 min (piatto 17)
- Controcolorato con ematossilina di Gill diluita 1:2 con acqua deionizzata per 2 minuti (piatto 18).
- Sciacquare l'ematossilina in eccesso con acqua deionizzata e risciacquare (piatti 19 e 20).
- Sciacquare con acqua di rubinetto Scott's per 30 s (soluzione bluificante) piatto 21.
- Lavare in acqua deionizzata per 10 min (piatto 22)
- Rimuovere le diapositive una alla volta: montarle con un mezzo di montaggio solubile in acqua.
- Leggere le diapositive al microscopio ottico.
