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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione istopatologica ed elaborazione dopo aver ottenuto la biopsia dell'arteria temporale
NOTA: La biopsia dell'arteria temporale (TAB) viene eseguita in anestesia locale e in condizioni sterili da un chirurgo certificato. Dopo aver prelevato chirurgicamente una sezione arteriosa di 3 cm sul lato più interessato, il campione viene fissato immediatamente in formalina per 24 ore, diviso in sezioni da 3 a 4 mm e immerso in paraffina, prestando particolare attenzione al corretto allineamento del tessuto nel blocco che viene poi conservato a temperatura ambiente. La selezione del campione viene eseguita dopo aver verificato la cartella clinica. La diagnosi si basa sui criteri dell'American College of Rheumatology del 1990 che richiedono che i soggetti soddisfino 3 dei 5 domini: età >50 anni, nuova cefalea, dolorabilità dell'arteria temporale, velocità di eritrosedimentazione >50 mm/ora con il metodo Westergren e TAB anormale. Per sicurezza, i guanti protettivi devono essere indossati in ogni momento quando si maneggiano i campioni, sostanze chimiche e anticorpi.
- Dai blocchi incorporati, tagliare sezioni spesse 4-5 μm utilizzando un microtomo e colorare con ematossilina ed eosina (H&E). Utilizzare una sezione di controllo di tessuto normale selezionato per garantire la qualità.
- Tagliare le sezioni con il galleggiante su un bagno d'acqua calda riscaldato a 40 °C per rimuovere le pieghe e raccoglierle con un vetrino microscopico in vetro rivestito. Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 °C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione al vetrino.
- Posizionare i vetrini su una piastra calda in forno a 60 °C per 60 minuti per facilitare l'asciugatura e l'aderenza della sezione al vetrino.
- Montare 3 sezioni sui vetrini del microscopio.
- Posizionare i vetrini in una griglia verticale e asciugarli per una notte a 37 °C per 24 ore.
- Mettere i vetrini in un contenitore e conservarli a 4 °C.
2. Preparazione immunoistochimica, deceratura, recupero dell'antigene e colorazione
- Caricare le diapositive in un rack per diapositive. Far scorrere la griglia attraverso i piatti come segue: due volte in xilene al 100% per 5 minuti con 10 secondi di agitazione delicata ogni 30 secondi, una volta in etanolo al 100% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 90% con agitazione di 10 secondi, una volta in etanolo al 70% con agitazione di 10 secondi e due volte in H2O a doppia distillazione con agitazione di 10 secondi.
nota: La manipolazione dello xilene e dell'acetone deve essere effettuata in cappe ventilate per evitare inalazione e tossicità respiratoria.
- Recuperare l'antigene trasferendo il rack in un contenitore di vetro con 200 mL di 10 mmol/L, tampone citrato pH 6,0 preriscaldato a 95 °C. Impostare il timer per 30 minuti a bagnomaria, quindi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi risciacquare con acqua corrente per 5 minuti.
- Rimuovere l'attività endogena della perossidasi incubando in 200 mL di perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti. Lavare i vetrini 3 volte in 200 μL di soluzione salina tamponata con Tris (TBSS).
- Rimuovere i vetrini dal rack e tamponare delicatamente ciascuno di essi per eliminare il tampone in eccesso. Per la colorazione, aggiungere 200 μl dei seguenti anticorpi primari, aggiungere vetrini coprioggetti sui vetrini e incubare in una camera umida per 1 ora a temperatura ambiente:
Anticorpo anti-recettore dei folati beta (FRB) diluito 1:800
Mouse monoclonale anti-umano CD68, diluizione 1:200
Coniglio policlonale anti-CD3 diluizione 1:100
nota: Anche le sezioni della placenta incluse in paraffina fissate in formalina sono state trattate come descritto nelle fasi da 2.1 a 2.9 e incubate con anti-FRB18 e utilizzate come controllo positivo. I risultati della colorazione sono stati ottenuti trovando la concentrazione ottimale di anticorpi ed è stata eseguita titolando l'anticorpo in doppie diluizioni (ad esempio, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Rimuovere il vetrino coprioggetti dopo l'incubazione e gettarlo. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBSS, scolare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 μl di soluzione di anticorpi secondari contenenti anticorpi secondari biotinilati anti-coniglio/topo per reagire con l'anticorpo primario non coniugato legato all'antigene tissutale. Posizionare i vetrini coprioggetti sui vetrini e incubare in una camera umida per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il vetrino coprioggetti dopo l'incubazione e gettarlo. Sciacquare i vetrini 3 volte per 2 minuti ciascuno con TBS, scolare e pulire il tampone in eccesso.
- Aggiungere 200 μl di sistema cromogeno diaminobenzidina (DAB)+tampone substrato (Imidazole HCl) e incubare per 10 minuti per visualizzare il modello di colorazione. Lavare con TBSS e poi in acqua corrente per 10 minuti.
- Controcolorare con ematossilina per 3 minuti.
- Montare i vetrini applicando 70 μl di mezzo di montaggio sulla superficie del vetrino. Inclinare lentamente il vetrino coprioggetti sul supporto di montaggio ed evitare di creare bolle mentre lo si abbassa in posizione. Attendere 24 ore per l'asciugatura.
3. Analisi istopatologica e immunoistochimica (IHC)
Esamina le sezioni colorate H&E e IHC da soggetti normali e GCA-positivi utilizzando un microscopio ottico.
- Per le sezioni colorate H&E
- Valutare l'architettura vascolare e identificare le cellule endoteliali nella tunica intima, le cellule muscolari lisce nella tunica media e i fibroblasti e i vasi vasorum nella tunica avventizia.
- Identificare le caratteristiche della GCA, che includono l'infiltrazione di linfociti e macrofagi/istiociti, l'iperplasia cellulare e la degradazione della lamina elastica interna.
- Analizzare l'infiltrato linfoistiocitario identificando e quantificando il numero di macrofagi rispetto ai linfociti. Valutare l'entità della rottura della lamina elastica interna e le alterazioni iperplastiche nelle cellule residenti e confrontarle con i controlli.
- Per le sezioni colorate IHC
- Esaminare il pattern di colorazione di FRB, prendendo nota della sua espressione da parte di un particolare tipo o tipi di cellule e della sua distribuzione all'interno degli strati vascolari e della sua relazione con l'infiltrato immunitario totale, il marcatore dei macrofagi totali, anti-CD68 e il marcatore dei linfociti pan anti CD3.
- Quantificare l'espressione delle cellule FRB, CD68 e CD3 contando le cellule colorate positivamente su 10 campi multipli ad alta potenza (hpf) selezionati casualmente e registrare le medie.
nota: L'identificazione di queste cellule e strutture normali e patologiche è stata eseguita da un patologo cardiovascolare e reumatologo certificato e i risultati sono stati registrati per tutti i casi.
- Cattura immagini rappresentative utilizzando una fotocamera digitale.
NOTA: Dopo questi passaggi, le aliquote rimanenti possono essere conservate a -80 °C.