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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prelievo di tessuti e reticolazione UV
- Eutanasia 2 topi adulti usando anidride carbonica (CO2) per 1-2 minuti o fino a quando la respirazione non si ferma. Quindi, eseguire la lussazione cervicale su ciascun topo.
- Raccogliere circa 100 mg di testicoli da topi di età appropriata (un testicolo adulto in questo studio) per ogni esperimento di immunoprecipitazione e posizionare i tessuti in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS).
- Rimuovere delicatamente la tunica albuginea con un paio di pinzette a punta fine.
- Aggiungere 3 ml di PBS ghiacciato in un tritatutto e triturare il tessuto con una leggera forza meccanica utilizzando un pestello di vetro sciolto (pestello di vetro di tipo A).
NOTA: Lo scopo di questo passaggio non è quello di lisare le cellule, ma di separare il tessuto. La conservazione della vitalità e dell'integrità cellulare è importante.
- Trasferire la sospensione tissutale in una piastra per colture cellulari (10 cm di diametro) e aggiungere PBS ghiacciato fino a 6 mL.
- Agitare rapidamente la piastra in modo che il liquido copra uniformemente il fondo della pirofila. Se il tessuto è macinato correttamente, saranno visibili tubuli seminiferi distribuiti uniformemente, mentre la presenza di grumi di tessuto indica che la dispersione tissutale non è ottimale.
- Crosslinka la sospensione tre volte con 400 mJ/cm2 a 254 nm su ghiaccio. Miscelare la sospensione tra ogni irradiazione.
nota: Per ogni nuovo esperimento, il reticolazione deve essere ottimizzato.
- Raccogliere la sospensione in una provetta conica da 15 mL e pellettare a 1.200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di PBS, quindi trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 4 °C e 1.000 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
- A questo punto procedere subito con il resto del protocollo, oppure congelare i pellet in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino al momento dell'utilizzo.
2. Preparazione delle perline
- Aggiungere 125 μL di microsfere magnetiche di proteina A per campione (pellet) a una provetta da centrifuga nuova.
nota: Utilizzare perle magnetiche di proteina G per gli anticorpi di topo.
- Posizionare il tubo sul magnete per separare le perle dalla soluzione. Dopo 10 s, rimuovere il surnatante. Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi ghiacciato.
nota: La successiva separazione delle microsfere magnetiche della proteina A segue questo passaggio. La composizione del tampone di lisi è 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM di NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% desossicolato di sodio; 1/50 di cocktail di inibitori della proteasi senza acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (aggiungere fresco).
- Risospendere le microsfere in 100 μL di tampone di lisi a freddo con 10 μg di anticorpo eCLIP. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 45 min.
nota: La concentrazione finale di anticorpi per l'immunoprecipitazione è di 10 μg/mL. Se la concentrazione di anticorpi non è nota, la quantità di anticorpi deve essere ottimizzata.
- Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi ghiacciato.
3. Lisi tissutale e digestione parziale dell'RNA
- Risospendere i pellet di tessuto in 1 mL di tampone di lisi a freddo (aggiungere 22 μL di cocktail di inibitori proteici privi di 50x (EDTA) e 11 μL di inibitore della RNasi a 1 mL di tampone di lisi).
- Risospendere due pellet reticolati UV e due pellet non reticolati per gruppo di esperimenti: pellet UV-crosslinked-1 per libreria eCLIP (UV-1); pellet UV-crosslinked-2 per libreria eCLIP (UV-2); pellet non reticolati-1 per la libreria eCLIP come controllo (non UV); pellet non reticolati-2 per IgG IP per dimostrare la specificità degli anticorpi.
nota: Il controllo ideale per la libreria eCLIP dei testicoli di tipo largo reticolati UV è quello dei testicoli knockout reticolati UV di topi della stessa cucciolata.
- Continuare a lisare i campioni su ghiaccio per 15 minuti (per evitare la degradazione di proteine e RNA).
- Sonicare in un sonicatore digitale al 10% di ampiezza per 5 minuti, a 30 s on/30 s off. Posizionare sempre il campione sul ghiaccio e pulire la sonda con acqua priva di nucleasi tra un campione e l'altro.
- Aggiungere 4 μl di DNasi a ciascuna provetta e mescolare bene. Incubare per 10 minuti a 37 °C, agitando a 1.200 giri/min.
- Aggiungere 10 μL di RNasi I diluita (4 U/μL RNasi I in PBS) e mescolare bene. Incubare per 5 minuti a 37 °C, agitando a 1.200 giri/min.
- Eliminare il lisato mediante centrifugazione a 15.000 x g per 20 minuti (a 4 °C).
- Raccogliere con cura il surnatante. Lasciare 50 μl di lisato e gettare il pellet con esso.
- Salva i campioni di input come RWB (run for western blot) e RRI (run for RNA isolation). Risparmiate 20 μl (2%) di campioni UV-1, UV-2, non UV e IgG come input per il caricamento del gel RWB. Risparmiate 20 μl (2%) di campioni UV-1 o UV-2 come input per il caricamento del gel RRI.
4. Immunoprecipitazione
- Aggiungere 1 mL di lisato (dal punto 3.7) alle perle (preparate nella sezione 2) e ruotare i campioni a 4 °C per 2 ore o durante la notte.
- Raccogli le perline con un supporto magnetico e getta il surnatante. Lavare le perle due volte con 900 μL di tampone ad alto contenuto di sale (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% sossicolato di sodio), quindi lavare le perle due volte con 900 μL di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
nota: Per il campione di IgG, mettere in pausa la procedura e conservarlo in ghiaccio in un tampone di lavaggio.