Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei materiali per l'iniezione
- Sterilizzare un ago e una siringa da 33 G: smontare e sterilizzare in autoclave a 115 οC. Preparare gli aghi per l'iniezione facendo lievitare in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
- Scongelare le particelle marcate in fluorescenza a temperatura ambiente per 5 - 10 minuti. Preparare la soluzione particellare per l'iniezione ricostituendola in una soluzione da 50 mg/ml in PBS sterile con ione calcio e ione magnesio (Ca2+/Mg2+).
nota: In questo protocollo vengono utilizzate particelle di origine fungina marcate con AF488 che sono state convalidate per i saggi di fagocitosi. Per un assorbimento ottimale, preparare le particelle fresche e immediatamente prima dell'iniezione.
NOTA 2: Le concentrazioni di particelle possono essere ottimizzate per ogni esperimento specifico.
2. Iniezione intravitreale di soluzione di perline
NOTA: Sono necessarie due persone per eseguire l'iniezione, in modo tale che la persona che esegue l'iniezione possa tenere il mouse e mantenere la messa a fuoco sul bulbo oculare, mentre l'altra persona passa la siringa caricata e spinge lo stantuffo.
- Anestetizzare il roditore mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/ml di ketamina e 10 mg/ml di xilazina alla dose di 20 μl/10 g di peso corporeo. Prima dell'iniezione, utilizzare un pizzico per le dita dei piedi per valutare il livello di anestesia.
nota: L'isoflurano ha un profondo effetto sulla funzione delle cellule mieloidi, pertanto il suo uso in questo test dovrebbe essere evitato.
- Caricare l'ago con 0,5 μl di soluzione di particelle marcate in fluorescenza.
- Appoggiare il mouse lateralmente sotto un microscopio operatorio (Figura 1A-B). Utilizzare un materiale morbido, ad esempio un impacco di gel, per un migliore posizionamento del mouse. Per i topi giovani in cui gli occhi non sono ancora aperti, aprire delicatamente le palpebre con l'aiuto di una pinza sottile a 45o angolata creando una fessura lungo la fessura da cui le palpebre si apriranno alla fine.
- Con l'aiuto di una pinza sottile a 45o angolata, applicare con cura una pressione intorno alla palpebra, in modo che il bulbo oculare sporga leggermente dall'orbita. Tenere la testa con due dita appena sopra l'orecchio e per la mascella e allungare delicatamente la pelle parallelamente alle palpebre per tenere l'occhio leggermente fuori dall'orbita. Fare attenzione a non afferrare troppo vicino alla gola (Figura 1B).
- Per perforare il bulbo oculare, inserire l'ago della siringa nel limbus corneale (dove la cornea e la sclera si collegano). Questo è visibile come un cerchio grigio nei topi pigmentati. Ritrarre leggermente l'ago per espellere un piccolo volume di liquido vitreo e quindi iniettare. La persona che esegue l'iniezione deve tenere delicatamente il topo con una mano e l'ago con l'altra; La seconda persona dovrebbe spingere lentamente lo stantuffo.
- Ritrarre lentamente la siringa. Applicare gocce idratanti per gli occhi per mantenere l'occhio idratato.
- Lascia che il roditore si riprenda in una gabbia sopra un termoforo e continua a monitorare l'animale. Se lavori con i cuccioli, non riportare l'animale in una gabbia con altri animali allertati fino a quando non respira e non è in grado di muoversi spontaneamente. Se lavori con adulti, non riportare il roditore in una gabbia con altri animali allertati fino a quando non riacquista la decubito sternale.
3. Prelievo di tessuto retinico
NOTA: Il tessuto retinico proveniente da occhi non iniettati con particelle marcate in fluorescenza dovrebbe essere raccolto come controllo per l'analisi citofluorimetrica. Sebbene il test possa essere eseguito utilizzando una singola retina, per ottenere le migliori prestazioni, due retine devono essere raggruppate insieme.
- Raccogliere il tessuto retinico 3 ore dopo l'iniezione intravitreale di particelle marcate in fluorescenza.
nota: Mentre il tempo dopo l'iniezione della soluzione di particelle può essere ottimizzato per ogni esperimento specifico, abbiamo scoperto che 3 ore dopo l'iniezione, l'assorbimento delle particelle può essere visto nella maggior parte degli strati della retina (Figura 1C-D).
- Sacrificare i topi per lussazione cervicale.
- Raccogli i bulbi oculari premendo delicatamente contro la palpebra con l'aiuto di una pinza sottile a 45o angolata per proptosare il bulbo oculare. Posizionare la pinza dietro il bulbo oculare e tirare.
- Sezionare la retina al microscopio da dissezione. Trasferire il bulbo oculare in una capsula di Petri contenente una piccola quantità di PBS con Ca2+/Mg2+. In un'area asciutta della capsula di Petri, perforare il bulbo oculare nel limbus corneale con la punta di una pinza sopraffina.
- Tenere il bulbo oculare con l'aiuto di una pinza sottile a 45o e utilizzare le forbici a molla per tagliare intorno al limbus corneale, fino a tagliare circa la metà della circonferenza del limbus corneale.
- Tenere il bulbo oculare con la pinza angolata a 45o e portare il bulbo oculare in PBS. Con un secondo paio di pinze sottili angolate a 45o strappare la cornea e la sclera. Il cristallino e la retina usciranno intatti.
- Separare il cristallino e la retina. Raccogliere la retina e trasferirla in una provetta di polistirene da 5,4 ml contenente 2 ml di PBS con Ca2+/Mg2+.
4. Preparazione di una sospensione a cella singola
- Preparare sospensioni unicellulari utilizzando un kit per la dissociazione del tessuto neuronale con piccole modifiche alle istruzioni del produttore. In breve, triturare le retine pipettando su e giù con una pipetta P1000 ed eseguendo una digestione enzimatica a 37 oC senza agitare.
5. Colorazione di sospensioni a singola cellula per l'analisi citofluorimetrica
- Risospendere le cellule in 200 μl di tampone di colorazione (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,2% e sodio azide allo 0,09%) e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U. Centrifugare per 5 min a 130 x g.
nota: L'azoturo di sodio è dannosa per l'uomo e per l'ambiente. Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati e smaltire i rifiuti in conformità con le normative locali.
- Capovolgere la piastra su un lavandino per scartare il surnatante. Per bloccare i recettori Fc, risospendere le cellule in 25 μl di tampone colorante contenente 5 μg/ml di anticorpo CD16/CD32 anti-topo per pozzetto. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 25 μl di tampone di colorazione contenente 0,5 μg/ml di Ly6C-APC-Cy7 anti-topo, 0,5 μg/ml di Ly6G-Pe-Cy7 anti-topo e 2,5 μg/ml di CD11b-BV650 anti-topo. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Centrifugare per 5 minuti a 130 x g. Capovolgere la piastra per eliminare il surnatante. Lavare rimettendo in sospensione le cellule in 200 μl di tampone di colorazione.
- Centrifugare per 5 minuti a 130 x g. Risospendere in 200 μl di tampone colorante contenente 0,5 μg/ml di ioduro di propidio (PI). Trasferire in provette per microtitolazione da 1,2 ml.
- Lavare i pozzetti con altri 100 μl di tampone di colorazione contenente 0,5 μg/ml di PI e raggruppare con i precedenti 200 μl nelle provette per microtitolazione da 1,2 ml. Si ottiene un volume totale di 300 μl di cellule colorate.
6. Analisi citofluorimetrica
- Utilizzando tre laser convenzionali (laser viola, blu e rosso), evitare i coloranti PE, PerCP-Cy5.5, BV510 e PI a causa della significativa fuoriuscita delle particelle fluorescenti AF488 estremamente luminose. Utilizzare un quarto laser (giallo) per ottimizzare questo test, in quanto consente di utilizzare anticorpi marcati con PE e PI (nel canale mCherry anziché nel canale PerCP-Cy5.5) (Figura 2).
nota: Se non è disponibile un laser giallo, utilizzare un colorante di esclusione delle cellule morte in un altro canale.
- Gate sulle celle PI negative (PI-) per escludere le celle morte (Figura 2B).
- Dopo aver escluso le cellule morte, il gate sulle cellule CD11b positive (CD11b+), questo includerà tutte le cellule mieloidi (Figura 2C).
- All'interno della popolazione CD11b+, il gate su Ly6C-/Ly6G- esclude neutrofili (CD11b+/Ly6G+) e monociti (CD11b+/Ly6C+; Figura 2D). Dopo il gating sulla microglia (qui definita come CD11b+/Ly6C-/Ly6G- per semplicità), dovrebbero essere visibili due popolazioni chiare; un negativo e un positivo per le particelle marcate in fluorescenza. Le cellule fagocitiche avranno assorbito particelle e saranno quindi AF488+ (Figura 2E).
nota: Le popolazioni Ly6C positive o Ly6G positive possono anche essere analizzate per misurare l'assorbimento delle particelle utilizzando questo approccio di colorazione. La percentuale di cellule fagocitiche CD11b+ è ben correlata con la percentuale di microglia fagocitaria (Figura 2F). Per i ricercatori senza esperienza di citometria a flusso, è possibile eseguire un'analisi più semplice con la sola colorazione CD11b, anche se ciò includerà neutrofili e monociti fagociti, nonché microglia. All'interno di questa popolazione CD11b+/Ly6C-/Ly6G-, queste cellule sono > 99% di microglia come giudicato dalla colorazione con i marcatori F4/80 e CX3CR1; Questi pennarelli possono essere aggiunti ma non sono necessari nelle nostre mani.
