Un test di citometria a flusso per identificare sottogruppi di cellule immunitarie nelle cellule mononucleate del sangue periferico

Abstract

Fonte: Torchia, M. L. G., et al. Discriminazione di sette sottogruppi di cellule immunitarie mediante citometria a flusso a due fluorocromo. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra una tecnica basata sulla citometria a flusso che utilizza due fluorocromi per identificare le cellule T CD4⁺ e CD8⁺, le cellule T γδ, le cellule B, le cellule natural killer (NK) e i monociti nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Dopo l'incubazione delle cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro i marcatori di superficie, i sottogruppi cellulari vengono identificati utilizzando una strategia di gating citofluorimetrico ottimale.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

NOTA: Questo protocollo è stato testato su cellule di sangue periferico isolate fresche o congelate e sangue intero.

1. Colorazione delle celle

NOTA: Scegliere coppie di fluorocromi praticamente senza sovrapposizione spettrale è importante per ridurre la diffusione dei dati a causa dell'elevata spillover di un fluorocromo nell'altro rivelatore di fluorocromo. Per ottenere un'identificazione ottimale di tutti i sottogruppi di cellule, è necessario utilizzare fluorocromi con un'elevata resa quantica come le coppie di anticorpi PE-BV421 e PE-APC.

1. Colorazione di PBMC freschi e congelati
   1. Trasferire 100 μl di PBMC (1 x 10⁶ celle) in una piastra con fondo a V a 96 pozzetti.
      nota: Qualsiasi numero di celle inferiore a 1 x 10⁶ può essere utilizzato con risultati simili.
   2. Centrifugare a 350 x g per 3 minuti a RT e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente un colorante fissabile vivo/morto che reagisce con l'ammina libera sulle proteine per 10 minuti per marcare le cellule morte.
   3. Preparare per ogni campione 30 μl di una miscela contenente tutti gli anticorpi (anti-CD3. -CD56, TCRγδ nel fluorocromo A e anti-CD4, CD8, CD19, CD14 nel fluorocromo B). Le concentrazioni di anticorpi sono indicate nella Tabella 1 e nella Tabella 2. In questa fase, possono essere aggiunti anche anticorpi titolati contro diverse molecole bersaglio e in diversi fluorocromi (ad esempio, Tabella 3).
      nota: La concentrazione di anticorpi può variare a seconda del produttore e del numero di lotto. Pertanto, è necessario eseguire test preliminari per ottenere il segnale ottimale. PBS, PBS/albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA), PBS/0,2% sodio azide o PBS/0,5% BSA/0,1% sodio azide sono stati utilizzati con risultati simili per diluire gli anticorpi. Le cellule possono anche essere colorate in volumi diversi da 30 μl per integrare facilmente questa metodologia nei protocolli di colorazione già esistenti.
   4. Centrifugare a 350 x g per 3 minuti a RT e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il cocktail di anticorpi a ciascun pozzetto e risospendere con cura senza generare bolle. Incubare per 30 minuti a RT al buio.
      nota: È possibile colorare i campioni a 4 °C con risultati simili.
   5. Aggiungere 150 μl di tampone di colorazione e centrifugare a 350 x g per 3 minuti a RT e aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 200 μL di PBS e acquisire i dati su un citometro a flusso. Se i volumi di colorazione vengono modificati, assicurarsi di diluire almeno 20 volte la miscela di anticorpi originale utilizzata per lavare gli anticorpi in eccesso.
      nota: Le cellule colorate possono essere fissate all'interno di PBS/2% paraformaldeide, conservate in frigorifero a 4 °C per una notte e quindi acquisite su un citometro a flusso il giorno successivo.
      cautela: La paraformaldeide è dannosa se ingerita e può causare irritazioni cutanee

2. Titolazione degli anticorpi

NOTA: La titolazione degli anticorpi è la fase più critica per ottenere dati riproducibili e di alta qualità. La titolazione di anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 e -TCR γδ segue la procedura standard mediante la quale la concentrazione di anticorpi per separare in modo ottimale i picchi positivi e negativi è derivata dall'indice di colorazione massimo. Devono essere selezionate le diluizioni al picco o più vicine al picco sul lato ascendente della curva dell'indice di colorazione (Figura 1A-C). L'anticorpo anti-CD4 è titolato in modo da collocare il picco della popolazione CD4 positiva tra le popolazioni CD3 singole positive e le cellule T CD3⁺/CD8⁺, più vicino al segnale CD3 single-positivo per discriminare meglio le popolazioni CD8dim (cellule T CD8⁺ γδ e cellule T NK). Sulla stessa linea, la titolazione CD56 mira a posizionare le cellule NK CD56⁺ tra la popolazione CD3⁺ e la popolazione CD3^-.

1. Curva massima dell'indice di
   NOTA: La titolazione di anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 e -TCR γδ segue la procedura standard mediante la quale la concentrazione di anticorpi per separare in modo ottimale i picchi positivi e negativi è derivata da una curva dell'indice di colorazione massima. Se al pannello vengono aggiunti anticorpi contro altri marcatori, anche questi devono essere titolati con una curva dell'indice di colorazione massima.
   1. Preparare una diluizione di 2 volte dell'anticorpo riempiendo 10 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti con 40 μl di tampone di colorazione. Nel primo pozzetto, aumentare il volume finale a 80 μl di tampone di colorazione e aggiungere l'anticorpo di interesse a una concentrazione 4 volte superiore a quella suggerita dal produttore.
   2. Mescolare bene e trasferire 40 μl nel secondo pozzetto. Mescolate bene e ripetete questo passaggio per tutti gli altri pozzetti.
   3. Colorare 10 campioni di PBMC o sangue intero con 30 μl delle 10 diverse diluizioni di anticorpi a 2 volte seguendo il protocollo descritto in precedenza.
   4. Acquisisci i dati con un citometro a flusso e traccia il segnale di ogni diluizione (Figura 1A).
   5. Gate sulle popolazioni negative e positive per ogni concentrazione di anticorpi. L'aumento della concentrazione di anticorpi può portare a un background più elevato. Pertanto, ridimensionare il cancello negativo di conseguenza.
   6. Per ogni concentrazione di anticorpi, estrarre informazioni sulla mediana e sulla deviazione standard per l'intensità fluorescente della popolazione negativa e sulla mediana per l'intensità fluorescente della popolazione positiva. Calcolare per ogni concentrazione di anticorpi l'indice di colorazione con questa formula: (intensità fluorescente mediana della popolazione positiva - intensità fluorescente mediana della popolazione negativa) ÷ (2 volte la deviazione standard dell'intensità fluorescente della popolazione negativa) (Figura 1B).
   7. Tracciare l'indice di colorazione rispetto alla concentrazione di anticorpi espressa come frazione della diluizione dell'anticorpo (ad esempio, diluizione 1:10 = 0,1) e identificare la concentrazione dell'anticorpo con il valore massimo dell'indice di colorazione (Figura 1C).
2. Titolazione degli anticorpi anti-CD4 e -CD56
   NOTA: La titolazione degli anticorpi anti-CD4 e -CD56 si basa sulla precedente titolazione degli altri marcatori nel pannello a due fluorocromi. Per l'anticorpo anti-CD4, la titolazione mira a collocare il segnale anti-CD4 tra il doppio segnale CD8⁺/CD3⁺ e la popolazione CD3 singolo positiva (Figura 1D).
   1. Titolare gli anticorpi anti-CD4 e CD56 con una strategia di diluizione di 2 volte come descritto in precedenza, aggiungendo ulteriori concentrazioni intermedie per identificare con precisione l'intervallo di concentrazione che consente di separare le cellule T CD4⁺ e le cellule NK dalle altre popolazioni cellulari.
   2. Titolare l'anticorpo anti-CD4 posizionando il segnale anti-CD4 tra il doppio segnale CD8⁺/CD3⁺ e la popolazione CD3 singolo positiva (Figura 1D).
      nota: Particolare attenzione deve essere prestata per separare chiaramente le cellule T CD4⁺ dalle popolazioni CD8⁺ dim.
   3. Titolare l'anticorpo anti-CD56 seguendo una strategia simile alla titolazione dell'anticorpo anti-CD4, posizionando le cellule NK tra le popolazioni CD3-negative e CD3-positive.

3. Strategia di Gating

1. Identificare le popolazioni di cellule linfocitiche e monocitiche e rimuovere le cellule morte e la maggior parte dei globuli rossi residui dall'analisi.
   1. Selezionare l'intera popolazione contenente linfociti e monociti in base all'area di dispersione anteriore rispetto a quella laterale (FSC-A vs SSC-A). Rimuovere gli aggregati di celle dall'analisi tramite l'altezza di dispersione diretta rispetto alla larghezza di dispersione diretta (FSC-H vs FSC-W) e l'altezza di dispersione laterale rispetto alla larghezza di dispersione laterale (SSC-H vs SSC-W).
   2. Utilizzare un marcatore di discriminazione vivo/morto per escludere dall'analisi le cellule morte positive e i globuli rossi residui. Gate su linfociti e monociti in base ai diversi profili FSC-A e SSC-A.
2. Strategia di gating a sette marcatori a due fluorocromo delle popolazioni linfocitiche.
   nota: All'interno del sottogruppo CD3 positivo, le cellule T CD4⁺, CD8⁺ e γδ possono essere separate utilizzando anticorpi che hanno come bersaglio esclusivo CD4, CD8 e il recettore γδ. In modo analogo, all'interno del sottogruppo CD3 negativo, le cellule B, le cellule NK e i monociti possono essere identificati in modo univoco utilizzando gli anticorpi contro CD19, CD56 e CD14, rispettivamente.
   1. Selezionare la porta dei linfociti e creare un dot plot con su ciascun asse uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo (Figura 2B).
   2. Gate sulle cellule T CD8⁺ identificate come cellule CD3⁺/CD8⁺ doppie positive nell'angolo in alto a destra del dot-plot (Figura 2B). Escludere la popolazione CD8 debole che potrebbe contenere cellule NKT. Gate sulle cellule T CD4⁺ identificate come popolazione tra le cellule T CD8⁺ e le singole popolazioni CD3 positive. Gate su cellule T γδ identificate come cellule CD3 alte. Suddividere le cellule T γδ in CD8 positive e CD8 negative.
   3. Gate sulle cellule NK identificate come la popolazione tra le cellule CD3-positive e CD3-negative. Suddividere le cellule NK in CD8 positive e CD8 negative. Gate sulle cellule B identificate come popolazione CD3-negativa CD19⁺ nell'angolo inferiore destro del dot plot.
   4. Selezionare le porte dei monociti e creare un grafico a punti con su ciascun asse uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo (Figura 2C). Gate sulla popolazione CD3^-/CD14⁺.

Tabella 1: Pannello di anticorpi utilizzato per la colorazione con due fluorocromo di cellule immunitarie di PBMC (combinazione BV421-PE).

bersaglio	clone	fluorocromo	venditore	concentrazione	scopo
CD3	UCHT1	BV421	Bd	1/20	lignaggio
CD56	NCAM16.2	BV421	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Cellule morte		L/D Blu	Lt	1/300	Discriminazione tra vivi e morti
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabella 2: Pannello di anticorpi utilizzato per la colorazione con due fluorocromo delle cellule immunitarie di PBMC (combinazione APC-PE).

bersaglio	clone	fluorocromo	venditore	concentrazione	scopo
CD3	UCHT1	Apc	Bd	1/20	lignaggio
CD56	NCAM16.2	Apc	Bd	1/60
TCRγδ	B1	Apc	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	Bd	1/300
Cellule morte		L/D Blu	Lt	1/300	Discriminazione tra vivi e morti
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Tabella 3: Pannello di anticorpi utilizzato per colorare la PBMC congelata da un paziente con mieloma multiplo.

bersaglio	clone	fluorocromo	catalogo	venditore	concentrazione	scopo
CD3	UCHT1	BV421	562426	Bd	1/20	lignaggio
CD56	NCAM16.2	BV421	562751	Bd	1/900
TCRγδ	B1	BV421	331217	bio	1/30
CD4	RPA-T4	Pe	555347	Bd	1/450
CD8	RPA-T8	Pe	555367	Bd	1/20
CD14	M5E2	Pe	555398	Bd	1/15
CD19	HIB19	Pe	555413	Bd	1/300
CCR7	G043H7	AF647	353217	bio	1/30	differenziazione
CD45RA	HI100	APC-H7	560674	Bd	1/60
CCR4	1G1	PE-Cy7	561034	Bd	1/60	Sottoinsiemi Th
CCR6	G034-E3	BV605	353419	bio	1/30
CXCR3	1C6/CXCR3	AF488	Codice: 561730	Bd	1/30
CD57	NK-1	PE-CF594	562488	Bd	1/900	Attivazione/Esaurimento
HLA-DR	G46-6	BV510	563083	Bd	1/30
CD16	3G8	BUV395	563784	Bd	1/30	NK, attivazione di monociti
Cellule morte		L/D Blu	L-23105	Lt	1/300	Discriminazione tra vivi e morti

Risultati

Figura 1: Titolazione rappresentativa degli anticorpi. (A) Il dot plot mostra l'espressione di CD8 su PBMC fresco colorato con la concentrazione indicata dell'anticorpo. (B) La tabella rappresenta la mediana e la deviazione standard dell'intensità fluorescente del CD8+, la popolazione CD8- mediana di intensità fluorescente e l'indice di colorazione derivato per ciasc...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CD3	BD Bioscienze	562426	Anticorpo per colorazione RRID: AB_11152082
CD56	BD Bioscienze	562751	Anticorpo per colorazione RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Bioscienze	331217	Anticorpo per colorazione RRID: AB_2562316
CD4	BD Bioscienze	555347	Anticorpo per colorazione RRID: AB_395752
CD8	BD Bioscienze	555367	Anticorpo per colorazione RRID: AB_395770
CD14	BD Bioscienze	555398	Anticorpo per colorazione RRID: AB_395799
CD19	BD Bioscienze	555413	Anticorpo per colorazione RRID: AB_395813
CD3	BD Bioscienze	555335	Anticorpo per colorazione RRID: AB_398591
CD56	BD Bioscienze	555518	Anticorpo per colorazione RRID: AB_398601
TCRgd	BD Bioscienze	331211	Anticorpo per colorazione RRID: AB_1089215
CCR7	Bioleggenda	353217	Anticorpo per colorazione RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Bioscienze	560674	Anticorpo per colorazione RRID: AB_1727497
CCR4	BD Bioscienze	561034	Anticorpo per colorazione RRID: AB_10563066
CCR6	BD Bioscienze	353419	Anticorpo per colorazione RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Bioscienze	Codice: 561730	Anticorpo per colorazione RRID: AB_10894207
CD57	BD Bioscienze	562488	Anticorpo per colorazione RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Bioscienze	563083	Anticorpo per colorazione RRID: AB_2737994
CD16	BD Bioscienze	563784	Anticorpo per colorazione RRID: AB_2744293
Cellule morte	Tecnologie di vita	L-23105	Discriminazione tra vivi e morti
Piastra con fondo a V a 96 pozzetti	Thermo fisher	Codice 249570	piastra per colorazione
Selezionatore di cellule FACSAria IIu	BD Bioscienze		Citometro a flusso
FCS Express 6	Software De Novo		Analisi FACS
Prisma Graphpad	Software GraphPad		analisi dei dati