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1. Codice a barre delle cellule del sangue lizzate/fissate
- Scongelare lentamente su ghiaccio i campioni di cellule lisate/fissate dalla conservazione a -80 °C; un massimo di 20 campioni possono essere etichettati con codici a barre univoci e raggruppati utilizzando questo sistema. Diluire il tampone permanente per codici a barre 10X di 1:10 con PBS; preparare abbastanza tampone per ~3 ml per campione.
- Riempire una mangiatoia non sterile con il CSM e una con il tampone per permanente con codice a barre 1X. Aggiungere 1 mL di CSM ghiacciato ai campioni appena scongelati, miscelare accuratamente con una pipetta e trasferire nelle rispettive provette cluster in polipropilene pre-marcate.
- Prelevare un campione da 10 μl per contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Normalizzare la conta delle cellule a 1,5-2 x 106 cellule per campione in ciascuna provetta a grappolo: rimuovere e scartare il volume delle cellule in eccesso superiori a 2 x 106 cellule.
- Centrifugare le celle a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone permanente 1X con una pipetta multicanale e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
- Allineare le provette a grappolo su un rack nello stesso ordine indicato sul tasto del codice a barre, in modo che il campione corrisponda al relativo codice a barre. Aggiungere 800 μl di tampone permanente per codici a barre 1X mediante pipetta multicanale a tutti i campioni nelle provette a grappolo senza toccare il pellet cellulare con i puntali della pipetta (senza miscelazione) per ridurre la perdita cellulare. Mettere da parte il rack con le provette a grappolo.
- Rimuovere le strisce di provette del kit per codici a barre Pd da 20 plex da -20 °C e scongelarle a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di tampone permanente per codici a barre 1X, mescolare accuratamente e trasferire 120 μl della miscela per codici a barre risospesa nei campioni cellulari corrispondenti nelle provette a grappolo.
- Miscelare accuratamente con la pipetta multicanale in modo che non vi siano contaminazioni incrociate tra i singoli campioni con codice a barre. Incubare le provette a grappolo per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire ai codici a barre di etichettare le cellule.
- Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante, quindi risospendere in 1 mL di CSM.
- Centrifugare e risospendere nuovamente in CSM.
nota: Ogni campione è ora etichettato con un codice a barre univoco e i campioni sono pronti per essere raggruppati.
- Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Con una singola pipetta e utilizzando lo stesso puntale, trasferire tutti i pellet cellulari in un volume residuo di ~70-80 μl in una provetta di polistirene. NON espellere il puntale della pipetta; Mettere da parte la pipetta singola con questo puntale.
- Con una pipetta multicanale e nuovi puntali, aggiungere ~100 μL di CSM a ciascuna provetta cluster originale per massimizzare il recupero cellulare. Con la pipetta singola con il puntale che è stato messo da parte, trasferire tutti i pellet cellulari in un volume residuo di ~100 μl nella stessa provetta di polistirene.
- Aggiungere CSM per completare la provetta di polistirene (~3 mL). Contare e registrare il numero di cella del set di codici a barre in pool. Centrifugare a 600 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Procedere alla colorazione dei campioni con codice a barre lo stesso giorno.
Nota: è normale aspettarsi una perdita di cellule del ~20-30% nel processo di codifica a barre.
2. Colorazione di cellule ematiche lisate/fissate con codice a barre e preparazione per l'analisi su strumento di citometria di massa
Nota: Ogni titolo 1X di anticorpo colorante (1 μL di anticorpo per 100 μL di reazione di colorazione), di solito può colorare 3-4 x 106 cellule. Pertanto, quando tutti i campioni con codice a barre vengono raggruppati in un'unica provetta, la quantità di anticorpi deve essere aumentata. Se 20 campioni con codice a barre ammontano a 30 x 106 cellule e ogni titolo 1X può colorare 3-4 x 106 cellule, il campione con codice a barre richiede solo un titolo 10X, invece di colorare ogni campione singolarmente, che richiederebbe una quantità di anticorpi 20X (1X per singola provetta). La concentrazione del numero di anticorpi rispetto alle cellule deve essere attentamente titolata per ogni singolo cocktail di anticorpi (non discussa qui).
- Colorare le cellule utilizzando anticorpi (Tabella dei materiali) per la colorazione superficiale e l'induzione delle citochine.
- Preparare il cocktail di colorazione superficiale calcolando la quantità da aggiungere e tenendo conto dell'errore di pipettaggio (ad esempio, se si colorano 20 campioni con codice a barre di 2 x 106 cellule in ciascun campione, è necessaria una colorazione del titolo 10X; per i calcoli del volume finale, compensare l'errore di pipettaggio creando una soluzione di colorazione finale 10,5X).
- Aggiungere 10 volte il volume di colorazione superficiale al pellet di cella con codice a barre. Per ridurre la perdita cellulare, con la stessa punta, mescolare e misurare il volume delle macchie superficiali e dei pellet cellulari.
- In base al volume delle cellule e al cocktail di colorazione, aggiungere CSM a un volume di colorazione finale di 50 μl per numero di campioni cellulari (ovvero, se si esegue un set di 20 campioni, 50 μl x 20 = 1 mL). Incubare per 30 minuti a 4 °C. Agitare il campione ogni 15 minuti per favorire una colorazione uniforme.
- Durante l'incubazione della macchia superficiale, preparare il tampone Perm/Wash (Tabella dei materiali) diluendo 1:10 con ddH2O filtrato. Preparare volumi di 2 mL per la permeabilizzazione e 5 mL per il lavaggio. Conservare a 4 °C o con ghiaccio.
- Rabboccare la provetta di colorazione superficiale con CSM e centrifugare a 600 x g a 4 °C per 5 minuti. Aspirare il surnatante. Risospendere il campione con codice a barre in 2 mL di tampone Perm/Wash a 4 °C, diluizione 1:10. Incubare a 4 °C per 20–30 minuti per permeabilizzare completamente le cellule.
- Centrifugare a 600 x g a 4 °C per 5 min e aspirare il surnatante.
- Per la colorazione intracellulare, seguire passaggi di colorazione simili (come per la colorazione superficiale). Tuttavia, utilizzare il tampone Perm/Wash a 4 °C, diluizione 1:10 invece del CSM per aumentare il volume totale di colorazione in modo che le cellule rimangano in un ambiente permeabilizzante durante la colorazione intracellulare.
- Aggiungere il cocktail di anticorpi intracellulari al pellet cellulare macchiato in superficie e permeabilizzato (passaggi 2.1.2-2.1.7). Portare il volume totale di colorazione a 50 μl per numero di campioni cellulari. Incubare per 60 minuti a 4 °C. Agitare il campione ogni 15 minuti per garantire una colorazione uniforme.
- Durante la colorazione intracellulare, preparare la soluzione intercalatrice: 900 μL di PBS filtrato + 100 μL di PFA filtrato al 16% (concentrazione finale di PFA all'1,6%) + 0,2 μL di 500 uM di colorante intercalante (Tabella dei materiali).
- Rabboccare il pellet cellulare + il cocktail di anticorpi intracellulari con tampone freddo 1:10 Perm/Wash.
- Centrifugare a 600 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare il surnatante. Rabboccare il tubo di colorazione con CSM. Conta e registra il numero di cella. Centrifugare a 600 x g a 4 °C per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione intercalante dal punto 4.9. Incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente per un'intercalazione completa o per una notte a 4 °C (i campioni in soluzione intercalante possono rimanere a 4 °C per un massimo di 1 settimana prima di eseguirli sullo strumento di citometria di massa).
- Preparare le cellule per lo strumento di citometria di massa.
- Rabboccare la provetta con 3 mL di ddH2O filtrato e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in 3 mL di ddH2O filtrato. Far passare questa sospensione attraverso un filtro da 100 μm per rimuovere eventuali detriti o aggregati che potrebbero potenzialmente ostruire lo strumento di citometria di massa.
- Contare e registrare il numero di cellule dopo la filtrazione. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C
- Preparare la soluzione del cordone di calibrazione (Tabella dei materiali) diluendola 1:10 in ddH2O filtrato.
- Risospendere le cellule colorate nel volume richiesto di soluzione diluita di microsfere di calibrazione 1:10 per ottenere una concentrazione di celle di ~1 x 106 cellule/mL.
nota: Per un CyTOF1 a 45 μL/min, l'ottimale raccomandato è 5 x 105 cellule/mL; per Helios a 30 μL/min, 7,5 x 105 cellule/mL.
- Procedere con l'analisi del campione sullo strumento di citometria di massa.