Un test di codifica a barre per la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule immunitarie

Abstract

Fonte: Baxter, R. M., et al. Analisi a singola cellula dell'immunofenotipo e della produzione di citochine nel sangue intero periferico tramite citometria di massa. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mette in evidenza un metodo proteomico a singola cellula che impiega anticorpi coniugati con metalli pesanti per la codifica a barre di cellule distinte. Successivamente, l'immunocolorazione e la citometria di massa vengono applicate per valutare le alterazioni fenotipiche e funzionali immunitarie nelle cellule immunitarie derivate da sangue intero umano.

Protocollo

1. Codice a barre delle cellule del sangue lizzate/fissate

1. Scongelare lentamente su ghiaccio i campioni di cellule lisate/fissate dalla conservazione a -80 °C; un massimo di 20 campioni possono essere etichettati con codici a barre univoci e raggruppati utilizzando questo sistema. Diluire il tampone permanente per codici a barre 10X di 1:10 con PBS; preparare abbastanza tampone per ~3 ml per campione.
2. Riempire una mangiatoia non sterile con il CSM e una con il tampone per permanente con codice a barre 1X. Aggiungere 1 mL di CSM ghiacciato ai campioni appena scongelati, miscelare accuratamente con una pipetta e trasferire nelle ri....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Condensazione magazzino: 10 mM; Conc finale: 5 μM
R848	Invivogen	TLRL-R848-5	Conc: 1 μg/μL; Conc finale: 1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Conc: 1 μg/μL; Conc finale: 0,1 μg/mL
PBS sterile	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD bioscienze	558049	Conc. di serie: 5X; Conc finale: 1X (diluito in ddH2O)
BD Tampone di perm/lavaggio Phosflow I	BD bioscienze	557885	Conc di serie: 10X; Conc finale: 1:10 (diluito in ddH2O)
Giri di velocità	Gibco	Codice 21870-076
Sodio azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Titolo Conc:>99,9%; Conc finale: 0,0002
Inibitore del trasporto delle proteine (PTI)	eBioscienze	00-4980-93	Conc di serie: 500X; Conc finale: 1X
Intercalatore di DNA	Fluidigm	Codice 201192B	Conc di serie: 500 μM; Conc finale: 0,1 μM
Buffer di permanente per codici a barre MaxPar	Fluidigm	201057	Conc di serie: 10X; Conc finale: 1X
Set di codici a barre Pd da 20 plex	Fluidigm	S0014	Magazzino Conc: n/a; Conc finale: n/a
Anticorpi utilizzati per la citometria di massa
Marcatori di superficie
CD1c	Bioleggenda	L161	Massa: 161
CD3	Bd	UCHT1	Massa: 144
CD4	Bioleggenda	SK3	Massa: 174
CD7	Bd	M-T701	Massa: 149
CD8	Bioleggenda	SK1	Massa: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Massa: 209
CD11c	Bd	B-ly6	Massa: 152
CD15	Bd	HI98	Massa: 115
CD14	Bioleggenda	M5E2	Massa: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Massa: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Massa: 163
CD21	Bioleggenda	Bu32	Massa: 141
CD27	Bd	L128	Massa: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Massa: 172
CD45 totale	Bioleggenda	HI30	Massa: 89
CD45RA	Bioleggenda	HI100	Massa: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Massa: 168
CD66	Bd	B1.1/CD66	Massa: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Massa: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Massa: 143
CD278/ICOS	Bioleggenda	C398.4A	Massa: 156
CD179/PD1	Bioleggenda	EH12.2H7	Massa: 162
IgD	Bioleggenda	IA6-2	Massa: 146
Igm	Bioleggenda	MHM-88	Massa: 151
CXCR5	Bd	RF8B2	Massa: 173
HLADR	Bioleggenda	L243	Massa: 167
Citochine
IL-1α	Bioleggenda	364-3B3-14	Massa: 147
IL-1β	Bioleggenda	H1b-98	Massa: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Massa: 157
IL-6	Bioleggenda	MQ2-13A5	Massa: 164
IL-8	Bd	E8N1	Massa: 160
IL-12/IL-23p40	Bioleggenda	C8.6	Massa: 171
IL-17A	Bioleggenda	BL168	Massa: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Massa: 176
MIP1β	Bd	D21-1351	Massa: 158
MCP1	Bd	5D3-F7	Massa: 170
Filtri IFNα	Miltenyi	LT27:295	Massa: 175
IFNγ	Bioleggenda	4S.B3	Massa: 165
PTEN	Bd	A2B1	Massa: 159
TNFα	Bioleggenda	Mab11	Massa: 166
Nota: se il produttore è indicato come Fluidigm, questo anticorpo è stato acquistato da Fluidigm con metallo pre-coniugato. Se il produttore è indicato come diverso da Fluidigm, questo anticorpo è stato autoconiugato utilizzando il kit di etichettatura multimetallo MaxPar (Fluidigm Cat: 201300) secondo il protocollo del produttore.