Utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per valutare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie

Abstract

Fonte: Ma, R. et al., Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore Piconewton da parte delle cellule immunitarie. (2021)

Il video mostra un metodo per valutare le forze dei recettori applicate dalle cellule immunitarie utilizzando nanoparticelle d'oro ancorate al polietilenglicole e sonde di tensione a forcina di DNA. Le interazioni delle cellule T CD8-positive innescano il dispiegamento della sonda, emettendo fluorescenza, mentre i filamenti di blocco sostengono il segnale per quantificare le forze applicate dalle cellule immunitarie.

Protocollo

1. Preparazione di oligonucleotidi

1. Sciogliere l'acido desossiribonucleico (DNA) del filamento del legante in acqua (resistività di 18,2 MΩ, utilizzata in tutto il protocollo). Agitare e far girare la soluzione con una centrifuga da tavolo. Regolare il volume dell'acqua in modo che la concentrazione finale sia di 1 mM. Convalidare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro a nanogocce per misurare l'assorbanza a 260 nm e determinare la concentrazione finale in base al coefficiente di estinzione dell'oligonucleotide.
   nota: Il filamento del ligando ha una modifica ad ogni terminale, 5' ammina e 3' biotina, per coniugarsi con il fluoroforo e presentare il ligando biotinilato. Il gruppo amminico nel filamento del legante deve essere coniugato con un fluoroforo. Il colorante Cy3B viene utilizzato per questa coniugazione a causa della sua elevata luminosità e fotostabilità, ma non è generalmente offerto in commercio e richiede una coniugazione interna. Di conseguenza, la sezione seguente descrive la coniugazione tra ammine e coloranti estere N-idrossisuccinimide (NHS). Per gli utenti finali che non hanno accesso a strutture o risorse per la modifica degli acidi nucleici, gli acidi nucleici modificati possono invece essere acquistati da fornitori di sintesi del DNA personalizzati che offrono coloranti brillanti e fotostabili, come la famiglia di coloranti Alexa e Atto.
2. Preparare 10 soluzioni di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 1 M di bicarbonato di sodio (NaHCO₃). Miscelare 10 μl della soluzione di filamento di ligando amminico 1 mM (10 nmol) con 10 μl di 10x PBS, 10 μl di 1 M NaHCO₃ e 60 μl di H₂O. Sciogliere 50 μg di Cy3B N-idrossisuccinimide (estere NHS) in 10 μl di dimetilsolfossido (DMSO) immediatamente prima dell'uso e aggiungere alla miscela per un volume di reazione totale di 100 μl. Aggiungere l'estere Cy3B NHS ultimo. Lasciare agire a temperatura ambiente per 1 ora o 4 °C durante la notte.
3. Preparare il filamento di bloccaggio Atto647N coniugando il filamento di bloccaggio dell'ammina con l'estere NHS Atto647N. Preparare 10 PBS e 1 soluzione M di NaHCO₃. Miscelare 10 μl della soluzione di filamento di bloccaggio dell'ammina 1 mM (10 nmol) con 10 μl di 10x PBS, 10 μl di 1 M NaHCO₃ e 60 μl di H₂O. Sciogliere 50 μg di estere Atto647N NHS in 10 μl di DMSO immediatamente prima dell'uso e aggiungere alla miscela per un volume di reazione totale di 100 μl. Aggiungere l'estere Atto647N NHS per ultimo. Lasciare agire a temperatura ambiente per 1 ora o 4 °C durante la notte.
4. Dopo le reazioni, rimuovere i sottoprodotti, il colorante in eccesso e i sali mediante filtrazione su gel desalinizzante P2. Diluire la miscela di reazione con H₂O fino a un volume totale di 300 μl, appropriato per la successiva fase di purificazione con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Aggiungere 650 μl di gel P2 idrato a un dispositivo centrifugo e centrifugare a 18.000 x g per 1 minuto. Rimuovere il liquido sul fondo del dispositivo, aggiungere la miscela di reazione alla colonna contenente il gel P2, centrifugare a 18.000 x g per 1 minuto e raccogliere la miscela di reazione sul fondo del dispositivo.
   nota: Il gel P2 deve essere idratato almeno 4 ore prima dell'uso con H₂O.
5. Purificare la miscela di reazione desalinizzata con HPLC utilizzando una colonna C18 destinata alla purificazione con oligonucleotidi, con solvente A: 0,1 M di acetato di trietilammonio (TEAA) in H₂O e B: acetonitrile (ACN) come fase mobile per un'eluizione a gradiente lineare 10-100% B in 50 minuti a una velocità di flusso di 0,5 mL/min. Iniettare la miscela di reazione desalinizzata in HPLC in fase inversa con un circuito di iniezione da 500 μL per la purificazione. Raccogliere il prodotto che ha un picco di assorbanza per l'acido desossiribonucleico, DNA (260 nm), e un picco di assorbanza per il fluoroforo (560 nm per Cy3B e 647 nm per Atto647N) ed essiccarli in un concentratore centrifugo sottovuoto per una notte (vedere la Figura 1A).
6. Ricostituire il prodotto oligocolorante essiccato in 100 μL di acqua. Determinare la concentrazione del filamento del ligando Cy3B e del filamento di bloccaggio Atto647N con lo spettrofotometro nanodrop. Assicurarsi che il rapporto di etichettatura del colorante sia vicino a 1:1. Se necessario, correggere l'assorbanza di 260 nm del colorante quando si determina la concentrazione di oligonucleotidi.
7. Convalidare il prodotto purificato con spettrometria di massa a tempo di volo a ionizzazione con desorbimento laser assistito da matrice (MALDI-TOF-MS) utilizzando la 3-idrossipropionaldeide (3-HPA) come substrato in ACN/H₂O al 50% con acido trifluoratico (TFA) allo 0,1% e citrato di ammonio 5 mg/mL utilizzando 0,5 μL di prodotto a 1-5 μM per la preparazione del campione MALDI-TOF-MS. Un esempio di spettro di massa può essere trovato nella Figura 1B.
8. Sciogliere il trefolo e il trefolo di ancoraggio in acqua e assicurarsi che la concentrazione delle soluzioni madre sia compresa tra 50 e 100 μM.
   nota: Il filo della forcina non è modificato e può essere sintetizzato direttamente da un fornitore. Il filo di ancoraggio ha un gruppo di ancoraggio tiolico e un quencher BHQ2 e può essere sintetizzato direttamente su misura da un fornitore.
9. Aliquot di tutti gli oligonucleotidi. Per un uso e una conservazione a breve termine, conservare questi oligonucleotidi a 4 °C. Per una conservazione a lungo termine, congelarli e mantenerli a -20 °C. A questo punto, tutti gli oligonucleotidi sono pronti per l'assemblaggio della sonda di tensione del DNA.
   nota: I cicli ripetuti di gelo-disgelo non sono problematici per gli oligonucleotidi.

2. Preparazione della superficie

NOTA: La preparazione dei substrati della sonda di tensione a forcina del DNA richiede due giorni. La sonda di tensione a forcina del DNA sarà funzionalizzata su vetrini coprioggetti.

1. Giorno 1
   1. Posizionare i vetrini coprioggetti da 25 mm su un rack di politetrafluoroetilene in un becher da 50 mL. Ogni rack può contenere fino a 8 vetrini. Sciacquare i vetrini coprioggetti immergendoli in acqua tre volte.
   2. Aggiungere 40 mL di una soluzione di etanolo in rapporto 1:1 (v:v) mescolata con acqua al becher contenente il rack e i vetrini coprioggetti e sigillare il becher con una pellicola di paraffina.
   3. Sonicare il becher per 15 minuti in un pulitore a ultrasuoni (frequenza operativa 35 KHz) per pulire i vetrini. Dopo la sonicazione, scartare il liquido e sciacquare il becher con la rastrelliera e i vetrini coprioggetti con acqua almeno 6 volte per rimuovere il solvente organico residuo.
   4. Preparare la soluzione fresca di Piranha mescolando acido solforico e perossido di idrogeno in un rapporto di 3:1. Per ottenere 40 ml di soluzione Piranha, aggiungere prima 30 ml di acido solforico a un becher pulito da 50 ml e poi aggiungere lentamente 10 ml di perossido di idrogeno, H₂O₂. La soluzione Piranha si riscalda e bolle rapidamente con l'aggiunta di H₂O₂. Mescolate delicatamente il piranha usando l'estremità di una pipetta di vetro.
   5. Quindi, trasferire il rack che contiene i vetrini coprioggetti nel becher contenente la soluzione Piranha delicatamente miscelata per l'incisione (Figura 2A). Lasciare idrossilare la soluzione Piranha e pulire i vetrini coprioggetti per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incisione Piranha, trasferire la rastrelliera utilizzando una pinzetta in acciaio o politetrafluoroetilene in un becher pulito da 50 ml con acqua e risciacquare nuovamente con acqua almeno 6 volte.
      cautela: Grandi quantità di sostanze organiche potrebbero reagire vigorosamente con la soluzione Piranha e causare un'esplosione. Fai attenzione e lavora sempre con la soluzione Piranha in una cappa aspirante. Assicurati di indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Non conservare mai la soluzione fresca di Piranha in un contenitore sigillato.
      nota: Il rapporto tra perossido di idrogeno e acido solforico deve essere mantenuto al di sotto di 1:2 (v:v) e non deve mai superare 1:1. Quando si immerge la rastrelliera con vetrini coprioggetti nella soluzione Piranha, posizionarli nella soluzione lentamente e con attenzione. Non gettare la soluzione subito dopo l'incisione, poiché è ancora attiva e calda. Lasciarlo nel bicchiere per una notte prima di versarlo nel contenitore dei rifiuti acidi.
   6. Immergere il rack contenente i vetrini coprioggetti in un becher da 50 ml con 40 ml di etanolo per rimuovere l'acqua. Scartare l'etanolo e ripetere 3 volte per assicurarsi che l'acqua sia stata rimossa.
   7. Quindi immergere il rack in 3% di aminopropil trietossisilano (APTES) (v/v) in 40 mL di etanolo per reagire con l'-OH sui vetrini coprioggetti per 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2B).
      nota: L'etanolo può essere sostituito dall'acetone.
   8. Sciacquare le superfici 6 volte immergendole in 40 ml di etanolo, quindi asciugare in forno a 80 °C per 20 minuti. Dopo il raffreddamento, conservare i vetrini coprioggetti essiccati modificati con ammina a -20 °C per un uso futuro (fino a 6 mesi).
   9. Coprire il lato interno inferiore delle piastre di Petri di plastica di 10 cm di diametro con pellicola di paraffina. Il film di paraffina impedisce ai vetrini coprioggetti di scivolare all'interno della capsula di Petri e aiuta a mantenere la soluzione per le successive fasi di funzionalizzazione sui vetrini. Posizionare i vetrini coprioggetti raffreddati modificati con ammina nelle piastre di Petri. Il lato da funzionalizzare deve essere rivolto verso l'alto.
   10. Per modificare i gruppi amminici sui vetrini, aggiungere 300 μL di poli(glicole etilenico) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) al 2,5% p/v di mPEG NHS (mPEG-SC) in NaHCO₃ 0,1 M e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (Figura 2C). Per ogni vetrino coprioggetti da 25 mm, pesare 1,5 mg di LA-PEG-SC e 7,5 mg di mPEG-SC. Sciogliere i reagenti NHS immediatamente prima di aggiungerli alle superfici, poiché hanno una breve emivita (~10 min) in una soluzione acquosa a temperatura ambiente. Dopo la reazione, sciacquare le superfici 3 volte con acqua.
       nota: La reazione NHS può essere eseguita a 4 °C durante la notte. I reagenti NHS hanno un'emivita più lunga prima dell'idrolisi a 4 °C, che è di circa 4-6 ore. Ciò si tradurrà in una procedura di preparazione della superficie di tre giorni.
   11. Aggiungere 100 μL di bicarbonato di sodio 0,1 M, NaHCO₃ contenente 1 mg/mL di acetato di sulfo-NHS a una serie di vetrini coprioggetti "sandwich" (due vetrini coprioggetti rivolti l'uno verso l'altro con tampone di reazione in mezzo). Lasciare che la passivazione avvenga per almeno 30 minuti. Per risparmiare il reagente, questo passaggio potrebbe essere eseguito con 50 μL di 1 mg/mL di sulfo-NHS acetato. Risciacquare con acqua tre volte dopo la passivazione.
   12. Aggiungere 0,5 mL di nanoparticelle d'oro (AuNP, 8,8 nm, acido tannico, 0,05 mg/mL) a ciascun vetrino coprioggetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2D). Per salvare il reagente, questo passaggio può essere eseguito inserendo anche due vetrini coprioggetti. Assicurarsi che non siano presenti sali nel sistema dai passaggi precedenti per evitare l'aggregazione di nanoparticelle d'oro. Non lasciare asciugare i vetrini coprioggetti dopo questo passaggio.
   13. Nel frattempo, pre-ibridare una forcina da 4,7 pN, il filamento del ligando Cy3B e il filamento di ancoraggio BHQ2 che formano le sonde di tensione del DNA costruite con un rapporto di 1,1:1:1 in 1 M di cloruro di sodio (NaCl) a 300 nM in una provetta con reazione a catena della polimerasi (PCR). Ricuocere i fili riscaldando la soluzione fino a 95 °C per 5 minuti, quindi raffreddare gradualmente diminuendo la temperatura a 20 °C per 30 minuti in un termociclatore.
   14. Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua tre volte dopo 30 minuti di incubazione con nanoparticelle d'oro. Aggiungere un ulteriore trefolo di ancoraggio BHQ2 (da materiale grezzo da 100 μM) alla soluzione di DNA ricotto per ottenere il rapporto tra il trefolo di ancoraggio BHQ2 e il trefolo di legante Cy3B 10:1. A questo punto, la soluzione di DNA dovrebbe contenere 300 nM di costrutto della sonda di tensione e 2,7 μM di filamento BHQ2. Aggiungere 100 μl per due vetrini coprioggetti per fare il "sandwich" (Figura 2E).
   15. Posizionare con cura una pallina di tessuto da laboratorio bagnata nella capsula di Petri (lontano dai vetrini coprioggetti) e sigillare la piastra con un film di paraffina per evitare che la soluzione si secchi. Coprire il piatto con un foglio di alluminio e incubare a 4 °C per una notte.
2. Giorno 2
   1. Lavare via le sonde in eccesso dai vetrini coprioggetti con 1x PBS. Verificare la qualità della superficie della sonda di tensione del DNA al microscopio a epifluorescenza.
   2. Preparare 40 μg/mL di streptavidina in 1x PBS e incubare su vetrini coprioggetti per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2F). Di solito, 100 μl sono sufficienti per un vetrino coprioggetti da 25 mm. Risciacquare con PBS 3 volte dopo l'incubazione per lavare via la quantità in eccesso di streptavidina.
   3. Preparare 40 μg/mL di anticorpo/ligando biotinilato in 1x PBS. Aggiungere 50-100 μl per sandwich e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 2G). Sciacquare con PBS tre volte dopo l'incubazione per lavare via la quantità in eccesso di anticorpi/ligando biotinilati.
   4. Assemblare con cura le camere di imaging pulite con le superfici. Le superfici possono essere facilmente incrinate durante il serraggio delle camere. Aggiungere 0,5-1 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) alle camere di imaging e tenerle pronte per l'imaging con le cellule (Figura 2H).

3. Imaging delle forze dei recettori cellulari

1. Preparare le cellule immunitarie di interesse nell'HBSS a 1-2 x 10⁶ cellule/mL.
   nota: Le cellule naïve OT-1 CD8+ sono utilizzate come esempio in questo articolo. Purifica le cellule T naïve OT-1 CD8⁺ dalla milza di topi sacrificati utilizzando il kit di isolamento delle cellule T CD8⁺ del topo MACS con un separatore di smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS) seguendo le istruzioni del produttore. Isolare e arricchire le cellule T CD8⁺ rimuovendo tutte le cellule T non CD8+ a cui si legava il cocktail di anticorpi che riducono i magneti. Risospendere le cellule T naïve OT-1 CD8+ purificate in HBSS a 2 x 10⁶ cellule/mL e mantenerle in ghiaccio prima dell'uso.
2. Controllare la qualità della superficie della sonda di tensione a forcina del DNA al microscopio a fluorescenza (obiettivo 100x) per il controllo di qualità prima di aggiungere ligandi o cellule di placcatura. Immagine e quantificazione dell'intensità media di fondo nel canale Cy3B della superficie di una sonda di tensione a forcina di DNA da almeno 5 diverse posizioni e 3 repliche. Mantenere coerenti le condizioni di acquisizione delle immagini in modo che questo valore possa essere utilizzato come indicatore affidabile della qualità della superficie e della densità della sonda (Figura 3C).
   nota: Quantificare il numero di filamenti di DNA per nanoparticella d'oro e il numero di nanoparticelle d'oro per μm² le prime volte della preparazione della superficie secondo la letteratura, che può essere utilizzato come un altro marcatore affidabile della qualità della superficie.
3. Piastra ~4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ cellule su ciascun vetrino coprioggetto funzionalizzato con sonda di tensione del DNA e lasciarle attaccare e diffondere per ~15 minuti a temperatura ambiente.
4. Quando le cellule vengono piastrate sulle sonde di tensione a forcina di DNA e iniziano a diffondersi, visualizzare i segnali di fluorescenza generati nel canale Cy3B con l'obiettivo 100x (Figura 2I).
5. Dopo che le cellule iniziano a produrre un segnale di tensione in tempo reale sulla superficie della sonda di tensione a forcina del DNA nel canale Cy3B, acquisire immagini in entrambi i canali Cy3B e Atto647N (la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) offre un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'epifluorescenza). Successivamente, aggiungere il filamento Atto647N alle camere di imaging a una concentrazione finale di 200 nM per l'ibridazione meccanicamente selettiva.
6. Dopo 10 minuti di incubazione, rimuovere rapidamente e delicatamente il tampone contenente il filamento di bloccaggio fluorescente Atto647N e sostituirlo con i sali freschi bilanciati di Hank. Acquisire nuovamente l'immagine in entrambi i canali Cy3B e Atto647N e determinare il coefficiente di correlazione di Pearson con il software Fiji.
7. Al momento di interesse per l'indagine, introdurre un filamento di bloccaggio non fluorescente nelle cellule della camera di imaging per memorizzare il segnale di tensione. Preparare il trefolo bloccante (100 μM) e aggiungerlo alle cellule a una concentrazione finale di 1 μM. Pipettare delicatamente per mescolare. La durata del blocco può variare, ma 10 minuti è il tempo consigliato.
8. Acquisizione di filmati time-lapse o immagini di punti finali in epifluorescenza per la mappatura qualitativa della tensione e l'analisi quantitativa, a seconda delle necessità (Figura 2J e Figura 4).
   nota: Se si desidera misurare la tensione in più punti temporali, avviare la cancellazione dei segnali di tensione memorizzati con l'aggiunta di un trefolo di sblocco. Per evitare un risciacquo eccessivo, viene utilizzata una concentrazione finale più elevata del filamento di sblocco a 2 μM per avviare una reazione di spostamento del trefolo mediata dalla tenuta della punta con il filamento di bloccaggio per 3 minuti, che cancella i segnali memorizzati (Figura 2J). Sciacquare delicatamente gli oligonucleotidi in eccesso con HBSS. La superficie della sonda di tensione a forcina del DNA e le cellule sono pronte per un altro ciclo di memorizzazione e mappatura della tensione. Lo sblocco dei segnali di tensione non è necessario se nello studio è di interesse un solo punto temporale.

Risultati

Figura 1: Esempi di preparazione di oligonucleotidi.(A) cromatogramma HPLC della purificazione del filamento di ligando Cy3B; b) spettri MALDI-TOF-MS del prodotto; (C) Tabella della massa calcolata e dei picchi m/z trovati del materiale di partenza e dell'oligonucleotide marcato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido 3-idrossipicolinico (3-HPA)	sigma	Codice: 56197	Matrice di Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	Preparazione della superficie
(3-amminopropil)trietossisilano	Acros	AC430941000	Preparazione della superficie
10x tampone per lisi dei globuli rossi	Bioleggenda	00-4333-57	buffer
8,8 nm nanoparticelle d'oro, acido tannico	Nanocomposix	ordine personalizzato	Preparazione della superficie
Atto647N Estere NHS	sigma	18373-1MG-F	Fluoroforo, oligo prep
Camera cellulare Attofluor, per microscopia	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A7816	Imaging
Siringhe BD solo con Luer-Lok	BD bioscienze	309657	cellule
Biotinilato anti-topo CD3e	ebioscience	13-0031-82	Anticorpo/ligando
Ovoalbumina pMHC biotinilata (SIINFEKL)	Impianto centrale NIH Tetramer presso la Emory University	Na	Anticorpo/ligando
Albumina sierica bovina	sigma	735078001	Bloccare le interazioni non specifiche
Filtri cellulari	Biologix	15-1100	cellule
Vetrino coprioggetti Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientifico	Codice C14784	Preparazione della superficie
Estere Cy3B NHS	GE Sanità	PA63101	Fluoroforo, oligo prep
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
etanolo	sigma	459836	Preparazione della superficie
Sali bilanciati di Hank (HBSS)	sigma	H8264	buffer
Perossido di idrogeno	sigma	H1009	Preparazione della superficie
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3,4K	Preparazione della superficie
Kit di avvio Midi MACS (LS)	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-301	cellule
Kit di isolamento delle cellule T CD8+ di topo	Miltenyi Biotec	Codice 130-104-075	cellule
Dispositivi centrifughi Nanosep MF	Laboratorio Pall	ODM02C35	Preparazione oligo
N. 2 vetrini coprioggetti rotondi in vetro	VWR	Codice 48382-085	Preparazione della superficie
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	Preparazione della superficie
Gel P2	Bio-rad	1504118	Preparazione oligo
acido solforico	EMD Millipore Corporation	Pannello SX1244-6	Preparazione della superficie
Acetato di sulfo-NHS	Thermo Fisher Scientifico	Codice 26777	Preparazione della superficie
attrezzatura
Colonna Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	Codice 653950-702		Preparazione di oligonucleotidi
Sistema di purificazione dell'acqua nanopuro Barnstead	Thermo Fisher		Acqua
Obiettivo CFI Apo 100× NA 1.49	Nikon		microscopia
Cubo Cy5	Chroma		microscopia
Dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatore di elettroni Evolve (EMCCD)	Fotometria		microscopia
Cromatografia liquida ad alte prestazioni	Agilent 1100		Preparazione di oligonucleotidi
Sorgente di epifluorescenza Intensilight	Nikon		microscopia
Spettrometro di massa a tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Preparazione di oligonucleotidi
Spettrofotometro UV-Vis Nanodrop 2000	Thermo Fisher		Preparazione di oligonucleotidi
Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti	Nikon		microscopia
Sistema di messa a fuoco perfetta Nikon	Nikon		microscopia
Software NIS Elements	Nikon		microscopia
Cubo a fascia quadrupla TIRF 405/488/561/647	Chroma		microscopia
Cubo RICM	Chroma		microscopia
Lanciatore TIRF con 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm	coerente		microscopia
Cubo TRITC	Chroma		microscopia
Nome Oligo	5' di modifica / 3' di modifica	Sequenza (da 5' a 3')	usare
Filamento di bloccaggio dell'ammina 15mer	5' modifica: nessuna modifica Modifica 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Blocco del segnale di tensione in tempo reale
15mer Atto647N trefolo di bloccaggio	5' modifica: Atto647N Modifica 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Blocco del segnale di tensione in tempo reale
Filo di bloccaggio non fluorescente 15mer	5' modifica: nessuna modifica Modifica 3': nessuna modifica	A AAA AAC ATT TAT AC	Blocco del segnale di tensione in tempo reale per l'analisi quantitativa
4.7 pN ciocca a forcina	5' modifica: nessuna modifica Modifica 3': nessuna modifica	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	Sonda a forcina
Filamento del ligando amminico	Modifica 5': /5AmMC6/ Modifica 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda a forcina
Trefolo di ancoraggio BHQ2	Modifica 5': /5ThiolMC6-D/ 3' modifica: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Sonda a forcina
Filamento di legante Cy3B	Modifica 5': Cy3B Modifica 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda a forcina
Sblocco del filo	5' modifica: nessuna modifica Modifica 3': nessuna modifica	TAG: GTA, GGG, TAT, AAA, TGT, TTT, TTT, C	Sblocco del segnale di tensione accumulata