Un test basato su CFSE per monitorare la migrazione delle cellule dendritiche cutanee verso i linfonodi drenanti nei topi infetti

Abstract

Fonte: Bollampalli, V. P., et al. Un test basato su CFSE per studiare la migrazione delle cellule dendritiche della pelle murina nei linfonodi drenanti durante l'infezione da Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra un test per il monitoraggio della migrazione delle cellule dendritiche a seguito di infezione del piede con Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG nei topi. In caso di infezione batterica, le cellule DC cutanee attivate vengono marcate con un colorante a base di carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) permeabile alle cellule. Dopo un intervallo adeguato per la migrazione delle DC al linfonodo popliteo drenante, le cellule linfonodali vengono isolate e sottoposte a immunocolorazione per i marcatori di superficie specifici per le DC. L'identificazione delle DC migrate viene eseguita utilizzando la citometria a flusso.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione delle scorte e stoccaggio CFSE

1. Preparare una riserva da 5 mM di 5- e 6-carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) in dimetilsolfossido. Vortice. Erogare aliquote da 100 μl in microprovette sterili con tappo a vite da 0,5 ml. Conservare le aliquote a -80 °C.

2. Topi

1. Utilizzare topi maschi o femmine consanguinei tra le 8 e le 12 settimane di età.....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isoflurano	Baxter	1001936060
5- e 6-carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE)	Invitrogen	Visualizzazione del materiale C1157
Dimetilsolfossido (DMSO)	sigma	D2650
Siero fetale bovino (FBS)	sigma	F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG)			Ceppo Pasteur, in casa
Soluzione di tripano blu	sigma	T8154
Edta			In casa
Aziduro di sodio	sigma	Episodio 2002
Pbs			In casa
Acqua filtrata			In casa
BD Plastipak siringa da 3 ml	BD Sistemi Medici Chirurgici	309658	Alternativa: siringa da 5 ml
Piastre a 6 pozzetti	TPP	Codice: 92006
Provette da centrifuga da 15 ml	TPP	Codice 91015	polipropilene
Tubi a fondo tondo da 5 ml	Falco BD	3272948	polistirene
Unità per anestesia Univentor 400	Univentor	8323001
Siringa Monojet 3/10ml	Medicarrier	8881511144	29 G x 1/2 pollice
Unità filtrante sterile	TPP	Codice 99500	membrana in PES
Omogeneizzatore EPPI-Pistill	Schuett biotech	3.200 512	polipropilene
Centrifuga Allegra X-30R	Beckman Coulter	B01145
Camera di conteggio Bürker	VWR	Codice 631-0920
Microprovetta con tappo a vite da 0,5 ml	Sarstedt	72,73	polipropilene
Provetta per microcentrifuga Eppendorf da 1,5 ml	VWR	700-5239	polipropilene
Filtri cellulari da 70 micron	VWR	734-0003
Software di analisi cellulare FlowJo	Stella dell'albero
anticorpo	clone	società
anticorpi
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BD Bioscienze
CD11b	M1/70	BD Bioscienze
CD11c	HL3	BD Bioscienze
CD16/CD32 (blocco Fc)	2.4G2	BD Bioscienze
CD326/EpCAM	G8.8	Bioleggenda
CD103	2.00E+07	Bioleggenda
CD80	16-10A1	Bioleggenda
CD86	GL-1	Bioleggenda