Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. A. fumigatus Cultura e condizioni
- Preparare il terreno di agar con glucosio minimo come descritto.
- Regolare il terreno a pH 6,5 utilizzando idrossido di sodio (NaOH) 1 M e sterilizzare in autoclave a 120 °C per 20 minuti.
- Lasciar raffreddare a 65 °C.
- Lavorando in una cappa a flusso sterile, versare 30 mL di terreno raffreddato in un pallone T75 e lasciarlo raffreddare con il collo del pallone appoggiato su una pipetta da 25 mL per creare una pendenza dell'agar.
- Strisciare il ceppo dsRed Af293-Aspergillus fumigatus sull'agar e incubare per 7 giorni a 37 °C + 5% di anidride carbonica (CO2). Due fiasche produrranno circa10-9 conidi in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di pre-biotinilazione.
2. A. fumigatus Etichettatura e preparazione
NOTA: Quando si esegue questo test per la prima volta, preparare il ceppo parentale Af293-A. fumigatus. Prelevare campioni di entrambi i ceppi in provette da microcentrifuga ed etichettare solo uno di ciascun ceppo come descritto di seguito. Ciò consentirà di avere conidi di controllo senza colore e conidi con un singolo colore, dsRed o Alexa Fluor 633 (AF633), per testare la configurazione e l'attrezzatura.
- Raccogliere i conidi di A. fumigatus immergendo la coltura con 30 ml di PBS + 0,05% di Tween-80. Filtrare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da 50 mL per rimuovere i frammenti ifali.
- Centrifugare a 805 x g per 10 minuti, rimuovere il surnatante e lavare una volta in 20 ml di PBS sterile. Accumulare conidi da due piastre dello stesso ceppo durante la fase di lavaggio.
- Dopo la fase di lavaggio, risospendere il pellet in 5 mL di PBS e trasferire 1 mL di aliquote di sospensione coniidale in provette per microcentrifuga. 1 mL di sospensione di ciascun ceppo è solitamente sufficiente per l'imaging di cellule vive. Avvolgere le aliquote rimanenti in un foglio di alluminio e conservare a 4 °C.
- Centrifugare le aliquote della sospensione coniidale a 9.300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL di bicarbonato di sodio 0,05 M (NaHCO3) pH 8,3.
- Preparare 10 mg di biotina/200 μL di dimetil solfossido (DMSO) ricostituendo 25 mg di biotina in 500 μL di DMSO. Aggiungere 10 μL di soluzione madre di biotina/DMSO alla provetta per microcentrifuga, coprirla con un foglio di alluminio e incubare per 2 ore su un bilanciere a 4 °C.
- Aliquotare il resto della soluzione madre di biotina/DMSO e congelare a -20 °C per essere utilizzato negli esperimenti successivi.
- Centrifugare per 10 minuti a 9.300 x g e rimuovere con cura il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL di 100 mM di Tris (idrossimetil) amminometano-cloridrato (Tris-HCl) pH 8,0 per 1 ora per disattivare la biotina fluttuante.
- Centrifugare per 10 minuti a 9.300 x g e rimuovere con cura il surnatante. Lavare il pellet due volte con 1 mL di PBS sterile e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
- Sciogliere 1 mg di streptavidina-AF633 in 0,5 mL di PBS per ottenere una soluzione madre da 2 mg/mL. Aggiungere 10 μL di 2 mg/mL di streptavidina-AF633 per 1 mL di sospensione conidiale e incubare per 40 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere ricoperto da un foglio di alluminio. La restante streptavidina-AF633 può essere congelata in aliquote per l'uso in esperimenti successivi.
- Centrifugare per 10 minuti a 9.300 x g e rimuovere con cura il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL di PBS e contare i conidi utilizzando un emocitometro a una diluizione 1:1.000 (1:100 e poi 1:10). Regolare la concentrazione di conidi a 3,6 x 106/mL con terreno indipendente da CO2, avvolgere in un foglio e conservare a 4 °C.
nota: I conidi sono ora marcati con AF633 e saranno indicati come conidi FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE).
- Opzionale: se è necessaria la stimolazione con conidi rigonfi, dopo aver contato i conidi (passaggio 2.9), diluire i conidi a 7,2 x 106/mL in terreno a base azotata di lievito (YNB) e aggiungere 500 μL di sospensione coniidale a 4,5 mL di terreno YNB in un pallone di Erlenmeyer da 50 mL sterilizzato in autoclave. Coprire e porre il pallone in un'incubatrice agitata (200 giri/min a 37 °C) per 6 ore.
- Trasferire il terreno in una provetta da 15 mL. Centrifugare a 805 x g per 10 min a temperatura ambiente e lavare una volta in PBS. Centrifugare nuovamente e risospendere il pellet in 1 mL di CO2 in terreno indipendente, ottenendo 3,6 x 106 conidi/mL.
NOTA: I conidi si aggregano frequentemente dopo essersi gonfiati, rendendo difficile un conteggio accurato, si consiglia di calcolare con il numero contato di conidi a riposo utilizzati.
3. Isolamento di neutrofili e monociti umani
- Prelevare 20 mL di sangue venoso da volontari sani in due provette da 10 mL contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Per ciascun donatore separatamente, versare 20 ml di sangue in una provetta da 50 ml e diluire con 15 ml di PBS.
- Sottoporre il sangue con 15 mL di una soluzione di isolamento dei linfociti (densità 1,077 g/mL) con una siringa e un ago di ferro. Posizionare l'ago sul fondo della provetta e forzare delicatamente la soluzione di isolamento dei linfociti verso l'esterno. Centrifugare a 630 x g per 20 min senza freno e bassa accelerazione.
- Preparare il PBS, raffreddato con ghiaccio.
nota: Le fasi 3.4 e 3.5 devono essere seguite contemporaneamente per generare monociti (3.4) e neutrofili (3.5).
- Usando una pastette, raccogli lo strato di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Questo è lo strato al centro tra il siero giallo (superiore) e lo strato della soluzione trasparente di isolamento dei linfociti (inferiore) e trasferito in una nuova provetta da 50 ml.
- Riempire la provetta con PBMC fino a 50 mL con PBS freddo e centrifugare a 582 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS freddo e risospendere in 1 mL di PBS per 20 mL di sangue di donatore utilizzato inizialmente.
- Effettuare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 μl della sospensione cellulare a 160 μl di PBS e 20 μl di blu di tripano. Contare le cellule con un emocitometro.
- Preparare una soluzione tampone aggiungendo 26 ml di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS) e 2,1 ml di EDTA 0,5 M a 500 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Centrifugare le cellule per 10 minuti a 515 x g e risospendere in 40 μl di soluzione tampone per 1 x 107 cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e aggiungere 10 μL di microsfere CD14 per 1 x 107 cellule, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C, assicurandosi di mescolare le provette ogni 5 minuti.
- Lavare le celle aggiungendo 1 mL di soluzione tampone per 1 x 107 celle e centrifugare a 515 x g per 10 minuti.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere fino a 1 x 108 cellule in 500 μL di soluzione tampone.
- Posizionare 1 colonna per campione su un separatore magnetico secondo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, lavare una volta la colonna con 500 μL di soluzione tampone.
- Pipettare i 500 μl di sospensione cellulare attraverso la colonna, attendere che la colonna si asciughi e quindi lavare ripetendo l'operazione tre volte con una soluzione tampone.
- Posizionare una nuova provetta da 15 mL sotto la colonna e rimuovere la colonna dal separatore magnetico. Quindi sciacquare le cellule dalla colonna nella provetta con 1 mL di soluzione tampone.
- Aggiungere 4 mL di soluzione tampone e centrifugare a 515 x g per 10 minuti, quindi risospendere in 1 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Effettuare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 μl della sospensione cellulare a 160 μl di PBS e 20 μl di blu di tripano. Contare le cellule con un emocitometro.
- Regolare la concentrazione cellulare su 6 x 105/mL con RPMI e seminare 200 μL su una piastra di imaging a base di vetro da 35 mm. Incubare per una notte a 37 °C con CO2 al 5%.
- Il giorno successivo, prima dell'imaging, rimuovere l'RPMI e aggiungere 200 μl di terreno indipendente da CO2.
nota: Questi monociti possono anche essere differenziati in vari sottogruppi di macrofagi prima dell'imaging. Se questa è una tecnica da esplorare, un ottimo punto di partenza è un recente articolo di Ohradanova-Repic et al.
- Dopo aver raccolto lo strato di PBMC, rimuovere tutto il siero e la maggior parte della soluzione di isolamento dei linfociti, ma fare attenzione a non rimuovere la piccola banda bianca sopra il pellet rosso poiché questo conterrà la maggior parte dei neutrofili.
- Preparare un tampone per lisi ipotonica 10x aggiungendo 83 g di cloruro di ammonio (NH4Cl) e 10 g di bicarbonato di potassio (KHCO3) in 1 L di acqua sterile. Conservare a 4 °C.
- Diluire questo brodo 10 volte con acqua sterile e aggiungerlo ai tubi. Quindi, capovolgere con cura 3 volte e incubare nel ghiaccio per 15 minuti.
- Centrifugare a 394 x g per 10 min e risospendere in tampone di lisi ipotonica per 10 min in ghiaccio.
- Centrifugare a 394 x g e lavare due volte con PBS freddo. Risospendere in 1 mL di terreno indipendente da CO2 per donatore.
- Effettuare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 μl della sospensione cellulare a 160 μl di PBS e 20 μl di blu di tripano. Contare le cellule con un emocitometro.
- Per la microscopia, aggiungere 200 μl della stessa sospensione cellulare a una piastra di imaging a base di vetro da 35 mm.
NOTA: L'imaging dei neutrofili o la citometria a flusso devono essere avviati immediatamente a causa della loro propensione a subire l'apoptosi se non stimolati. Se ciò non è possibile, i neutrofili devono essere tenuti in ghiaccio e utilizzati il prima possibile (entro lo stesso giorno).
4. Microscopia video su cellule vive
NOTA: La scelta del microscopio dipenderà da ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione del microscopio dovrà includere uno stadio invertito, una camera ambientale riscaldata a 37 °C e filtri di eccitazione/emissione appropriati per dsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). I conidi FLARE non funzionano con il laser a 488 nm al posto del laser a 532/561 nm per dsRed. Quando si esegue questo esperimento per la prima volta, utilizzare i conidi di controllo senza colore e con un singolo colore per verificare la fluorescenza di fondo e il bleed-through tra i canali dsRed e AF633.
- Accendere il riscaldatore del microscopio prima dell'esperimento e attendere un tempo sufficiente affinché la camera di controllo ambientale si riscaldi a 37 °C. Il tempo impiegato per la stabilizzazione della temperatura della camera varia a seconda delle diverse configurazioni del microscopio.
- Accendere il microscopio e il computer e caricare il software di imaging. Monta la piastra di imaging sul tavolino del microscopio e regola la messa a fuoco per trovare i neutrofili o i monociti umani.
- Per dsRed e AF633, impostare la potenza del laser su 10% e il tempo di esposizione su 1 s nelle impostazioni di acquisizione.
- Rimuovere il vetrino di imaging e aggiungere 100 μl di 3 x 106/mL di sospensione di conidi FLARE nei pozzetti appropriati (volume totale 300 μl/pozzetto). Registrare il tempo in cui i conidi FLARE vengono aggiunti al piatto.
- Rimetti la diapositiva sul tavolino e regola la sensibilità della fotocamera per dsRed e AF633 per vedere chiaramente i conidi ma non sovraesporre l'immagine. Impostare un elenco di punti di tappa se è necessaria l'acquisizione di più punti.
- Avvia l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco, i canali sono ottimizzati e il tempo di ciclo e la durata sono impostati. Il tempo del ciclo e la durata dell'imaging dipendono dalla domanda sperimentale. L'obiettivo è quello di mantenere il tempo di ciclo il più breve possibile (≤2 min) con 1 min che consente un'analisi approfondita delle dinamiche di assorbimento.
