Utilizzo di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare l'output sinaptico dalle cellule T

Abstract

Fonte: Céspedes, P. F., et al. Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare l'output di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video illustra la ricostituzione di cellule sintetiche presentanti l'antigene attraverso i doppi strati lipidici supportati da perline e la loro applicazione nella valutazione dell'output sinaptico generato dalle cellule T attivate.

Protocollo

1. Calibrazioni della densità proteica su BSLB (Bead-supported lipid doublelayers)

1. Prima di prelevare le perle di silice non funzionalizzate da 5,00 ±0,05 μm di diametro, mescolare bene la soluzione madre e risospendere eventuali grossi grumi di perle sedimentate sul fondo dei palloni.
   NOTA: Le perle di silice tendono a sedimentare rapidamente, il che potrebbe portare a errori di conteggio. Miscelare energicamente pipettando su e giù metà del volume massimo di una micropipetta P1000.
2. Diluire 1 μL di soluzione di perle in 1.000 μL di PBS, contare le microsfere utilizzando una camera emocitometrica e calcolare la loro concentrazione per mL.
   nota: La colorazione blu di tripano non è necessaria per visualizzare le perle di silice.
3. Calcolare il volume di perle di silice necessarie per 5 × 10⁵ BSLB finali per punto della titolazione.
4. Trasferire il volume richiesto di perle di silice in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Lavare le perle di silice tre volte con 1 mL di PBS sterile e centrifugare le microsfere per 15 s su una microcentrifuga da banco a RT (a giri fissi).
   NOTA: Quando si rimuove la soluzione di lavaggio, evitare di disturbare il pellet del tallone. Una piccola colonna tampone non influenzerà la diffusione dei liposomi che compongono la miscela master di liposomi poiché anche questi sono nella PBS.
6. Preparare tre volumi della miscela master dei liposomi per assemblare il BSLB sulle perle di silice lavate (ad esempio, se il volume totale iniziale delle perle di silice è di 20 μl, preparare un minimo di 60 μl della miscela master dei liposomi).
7. Per titolazioni in biotinyl cap PE mol%
   1. Preparare le miscele master lipidiche contenenti 5 diluizioni di Biotinyl Cap PE.
      1. Diluire 0,4 mM di Biotinyl Cap PE mol% in una matrice DOPC al 100%.
      2. Miscelare ciascun punto di titolazione Mol% di Biotinyl Cap PE con un rapporto 1:1 (vol: vol) con una soluzione di 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) in modo tale che un ultimo 12,5% mol% di lipidi contenenti Ni sia presente in tutte le titolazioni.
         nota: Il 12,5 mol% (vol:vol%) di lipidi contenenti Ni rappresenta la composizione lipidica mista dei BSLB su cui le proteine marcate con His-taged possono anche essere testate in calibrazioni parallele. Ad esempio, poiché tutti gli stock di liposomi sono preparati alla stessa concentrazione molare, per raggiungere la miscela mol% target in 200 μl di miscela liposomica finale, è sufficiente mescolare 100 μl di 25 mol% di DGS-NTA contenente Ni con 100 μl di DOPC al 100 mol%.
   2. Trasferire 5 × 10⁵ perle di silice lavate in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, in modo da assemblare un punto di titolazione in mol% di PE con tappo in Biotinyl Cap per provetta.
   3. Aggiungere le miscele master di titolazione Biotinyl Cap PE mol% alle perle di silice lavate e mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Evitare la formazione di bolle, che in eccesso distruggono il doppio strato lipidico.
   4. Aggiungere gas Argon (o Azoto) sul tubo contenente i BSLB ora in formazione per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.
   5. Aggiungere l'argon alle scorte lipidiche da 0,4 mM prima dello stoccaggio e manipolare utilizzando una tecnica sterile.
      nota: Collegare un piccolo tubo alla bombola di gas Argon/Azoto. Prima di aggiungere gas ai tubi, regolare il regolatore della bombola del gas in modo che la pressione non sia impostata su un valore superiore a 2 psi. Collegare un puntale per pipetta sterile al tubo di uscita per dirigere il flusso di gas all'interno del fondo di liposomi per 5 secondi e chiudere rapidamente il coperchio. Nel caso di stock lipidici, sigillare il coperchio della provetta con pellicola di paraffina prima di riporla a 4 °C.
   6. Spostare i BSLB in un miscelatore da laboratorio verticale ad angolo variabile (vedere la Tabella dei materiali) e mescolare per 30 minuti a RT utilizzando una miscelazione orbitale di 10 giri/min.
      nota: Questo passaggio impedirà la sedimentazione delle perle durante la formazione del doppio strato lipidico supportato.
   7. Centrifugare le perle per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco, quindi lavare tre volte con 1 mL di HBS/HSA (BSA) per rimuovere i liposomi in eccesso.
   8. Bloccare i BSLB formati aggiungendo 1 mL di caseina al 5% o BSA al 5% contenente 100 μM di NiSO₄ per saturare i siti NTA e 200 nM di streptavidina per rivestire uniformemente tutti i siti di ancoraggio della biotina sui BSLB. Miscelare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale e incubare nel miscelatore verticale per non più di 20 minuti a RT e 10 giri/min.
   9. Centrifugare i BSLB per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco, quindi lavare tre volte con 1 mL di tampone HBS/HSA (BSA).
      nota: Mantenere le perle lavate verticalmente con un piccolo volume di tampone di lavaggio che copre i BSLB. Evitare la disidratazione dei BSLB poiché l'aria distruggerà il doppio strato lipidico.
8. Per la titolazione di proteine marcate con His-tagged su BSLB contenenti NTA DGS-(Ni)
   1. Preparare tre volumi di master mix liposomico contenente un finale del 12,5% mol% di DGS-NTA(Ni).
   2. Utilizzare la master mix di liposomi per risospendere le perle di silice lavate e mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Evitare la formazione di bolle, che in eccesso danneggiano il doppio strato lipidico.
   3. Aggiungere gas Argon (o Azoto) sul tubo contenente i BSLB ora in formazione per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.
   4. Aggiungere l'argon alle scorte di lipidi da 0,4 mM prima della conservazione e manipolare utilizzando una tecnica sterile.
   5. Spostare i BSLB nel miscelatore verticale e mescolare per 30 minuti a RT utilizzando la miscelazione orbitale a 10 giri/min.
   6. Centrifugare le perle per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco, quindi lavare tre volte con 1 mL di HBS/HSA (BSA) per rimuovere i liposomi in eccesso.
   7. Bloccare i BSLB formati aggiungendo 1 mL di caseina al 5% (o BSA al 5%) contenente 100 μM di NiSO4 per saturare i siti NTA sui BSLB. Mescolare delicatamente e incubare nel miscelatore verticale per non più di 20 minuti a RT e 10 giri/min.
   8. Lavare tre volte utilizzando HBS/HSA (BSA) per rimuovere la soluzione bloccante in eccesso.
   9. In una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U preparare diluizioni seriali 2 volte delle proteine.
      1. Preparare una concentrazione iniziale di 100 nM per la proteina di interesse in un volume totale di 200 μL di tampone HBS/HSA (BSA), distribuire 100 μL di questa soluzione nella prima colonna e i restanti 100 μL sopra la colonna #2 contenente 100 μL di tampone HBS/HSA (BSA).
      2. Continuare trasferendo in serie 100 μl dalla colonna #2 alla colonna #3 e ripetere se necessario per coprire tutti i punti di titolazione. Lasciare l'ultima colonna della serie senza proteine, poiché questa verrà utilizzata come riferimento vuoto per la quantificazione.
   10. Risospendere i BSLB preparati in un volume tale che 5 × 10⁵ BSLB siano contenuti in 100 μl di tampone HBS/HSA (BSA).
   11. Trasferire 100 μl della sospensione BSLB nei pozzetti di una seconda piastra a 96 pozzetti con fondo a U, in modo che ogni pozzetto riceva 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Centrifugare la seconda piastra contenente BSLB per 2 minuti a 300 × g e RT ed eliminare il surnatante.
   13. Trasferire i volumi di 100 μl dalla piastra di titolazione delle proteine alla piastra contenente i BSLB sedimentati. Miscelare delicatamente, evitare la generazione di bolle in eccesso durante il pipettaggio e incubare per 30 minuti a RT e 1.000 giri/min utilizzando un agitatore per piastre. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio.
   14. Lavare la piastra tre volte con tampone HBS/HSA (BSA) utilizzando fasi di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT.
   15. Se la proteina ricombinante utilizzata nella calibrazione è direttamente coniugata ai fluorocromi e ha valori F/P noti.
   16. Se la proteina ricombinante utilizzata nella calibrazione non è marcata o coniugata ai fluorocromi o non è disponibile uno standard di microsfere MESF, utilizzare gli anticorpi coniugati Alexa Fluor 488 o 647 con valori F/P noti per colorare il BSLB rivestito di proteine.
   17. Colorazione con concentrazioni saturanti di anticorpi di quantificazione.
       NOTA: A seconda del livello di espressione target, questi variano tra 5 e 10 μg/mL.
   18. Colorare per 30 minuti a RT e 1.000 giri/min utilizzando uno scuotitore a piastre. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio.
   19. Lavare due volte con tampone HBS/HSA (BSA) e una volta con PBS utilizzando fasi di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT.
       nota: Utilizzare PBS, pH 7,4 per risospendere i BSLB lavati prima dell'acquisizione. Non utilizzare tamponi contenenti proteine, poiché ciò porta alla formazione di bolle durante la miscelazione automatica dei campioni con campionatori ad alto rendimento.
   20. Acquisire gli standard MESF, assicurandosi che i picchi più luminosi rimangano nell'intervallo di rilevamento lineare per il rivelatore di quantificazione (canale), come mostrato nella Figura 1B (vii).
   21. Acquisire i campioni manualmente o utilizzando HTS. Se si utilizza quest'ultimo, risospendere i BSLB in 100 μL di PBS e acquisire 80 μL utilizzando una velocità di flusso compresa tra 2,5 e 3,0 μL/s, un volume di miscelazione di 100 μL (o il 50% del volume totale se il volume di risospensione è inferiore), una velocità di miscelazione di 150 μL/s e cinque miscele per garantire che i BSLB siano monodispersi.
   22. Esporta i file FCS.
   23. Concentrarsi sui singoli eventi per le analisi (Figura 2A), poiché doppietti o triplette introdurranno errori nella determinazione. Utilizzare l'identificazione nidificata di singoli eventi come indicato nel passaggio del protocollo 1.2.3.
   24. Misurare l'MFI di ciascuna frazione MESF (1-4) e sottrarre l'MFI delle perle vuote per estrarre le MFI corrette (cMFI).
   25. Eseguire un'analisi di regressione lineare per estrarre la pendenza (b) di MESF rispetto al cMFI calcolato per gli standard MESF.
   26. Estrarre l'MFI di ciascun punto di titolazione e sottrarre l'MFI delle microsfere senza proteine per ottenere cMFI.
   27. Dividere le cMFI con la pendenza calcolata per estrarre il MESF legato alle BSLB per ogni punto di titolazione.
   28. Dividi il MESF legato ai BSLB per il valore F/P dell'anticorpo di quantificazione per estrarre il numero medio di molecole legate per BSLB.
   29. Utilizzando il diametro dei BSLB (5,00 ± 0,05 μm), estrarre l'area della superficie del cordone (SA = 4pr2) per calcolare le densità finali delle proteine (molec./μm²) per punto di titolazione (concentrazione proteica).
   30. Eseguire una nuova analisi di regressione della concentrazione proteica rispetto alla densità proteica per calcolare la pendenza (b) della linea di best fit.
       nota: La concentrazione del 12,5 mol% di DGS-NTA(Ni) conferisce una capacità di ancoraggio massima di circa 10.000 molec./μm2 10 senza indurre l'attivazione aspecifica delle cellule T o influenzare la mobilità laterale degli SLB.

2. Esecuzione di esperimenti di trasferimento sinaptico tra cellule T e BSLB

1. Prima di eseguire l'esperimento di trasferimento sinaptico
   1. Acquisire BSLB non fluorescenti, BSLB con lipidi fluorescenti, cellule non colorate (o perle di compensazione; vedere la Tabella dei materiali) e cellule colorate in un solo colore (o perline di compensazione) per identificare le interazioni dello spettro di fluorescenza dello strumento. Concentrarsi sui rivelatori con un'elevata diffusione dello spillover per riprogettare il pannello policromatico, aumentare la sensibilità e ridurre l'errore di misura sui rivelatori critici.
   2. Titolare gli anticorpi di rilevamento per trovare la concentrazione ottimale, consentendo il rilevamento di eventi positivi senza compromettere il rilevamento di negativi.
      nota: Ripetere questo passaggio ogni volta che si verifica un cambiamento del lotto di anticorpi poiché i valori F/P e la luminosità variano da lotto a lotto.
   3. Opzionale: ottimizza le tensioni PMT acquisendo il campione a diversi intervalli di tensione (ad esempio, una passeggiata di tensione) per trovare i PMT che portano a un segnale ottimale rispetto al rumore (ad esempio, separazione di negativi e positivi, garantendo al contempo che il segnale della popolazione più brillante rimanga nell'intervallo lineare).
2. Misura del trasferimento dell'output delle cellule T ai BSLB
   1. Preparare RPMI 1640 integrato (qui R10 medium) contenente il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 100 μM di aminoacidi non essenziali, 10 mM di HEPES, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Utilizzare il terreno R10 per coltivare ed espandere le cellule T.
   2. Il giorno 1, isolare le cellule T dal sangue periferico o dalle camere del sistema di leucoriduzione (LRS). Utilizzare kit per l'isolamento e la separazione delle cellule di immunodensità (vedere la Tabella dei materiali) per l'arricchimento delle cellule T CD4+ e CD8+ umane.
   3. Seminare le cellule a una concentrazione finale compresa tra 1,5 e 2,0 × 10⁶ cellule/mL, utilizzando piastre a 6 pozzetti con non più di 5 mL totali per pozzetto.
   4. Attivare le cellule T utilizzando un rapporto 1:1 di perline magnetiche di attivazione delle cellule T umane (anti-CD3/anti-CD28) (vedere la Tabella dei materiali) e aggiungere 100 UI di IL-2 umana ricombinante per supportare la proliferazione e la sopravvivenza cellulare.
   5. Il giorno 3, rimuovere le perline magnetiche attivanti utilizzando le colonne magnetiche (vedere la Tabella dei materiali). Assicurarsi che le perle magnetiche rimangano attaccate ai lati del tubo prima di recuperare le celle per ulteriori fasi di lavaggio.
   6. Lavare nuovamente le perle magnetiche con 5 ml di terreno fresco R10, mescolare bene e reinserirle nel magnete. Recuperare questo volume e mescolarlo con le cellule recuperate nel passaggio 1.2.5.
   7. Risospendere le cellule a 1,5-2 × 10⁶ cellule/mL in R10 fresco contenente 100 U/mL di IL-2. Reintegrare il terreno dopo 48 ore, assicurandosi che l'ultima aggiunta di IL-2 sia 48 ore prima del giorno della sperimentazione (giorni da 7 a 14 di coltura).
   8. Il giorno dell'esperimento di trasferimento sinaptico, preparare il terreno del saggio di trasferimento sinaptico integrando il terreno RPMI 1640 privo di rosso fenolo con il 10% di FBS, 100 μM di aminoacidi non essenziali, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Non includere IL-2 umana ricombinante.
   9. Contare le cellule utilizzando la colorazione con blu di tripano o l'esclusione di corrente elettrica e risospenderle fino a una concentrazione finale di 2,5 × 10⁶ cellule/mL nel terreno. Se si osserva un'eccessiva morte cellulare (>10%), rimuovere le cellule morte/morenti utilizzando una miscela di polisaccaride e diatrizoato di sodio (vedere la Tabella dei materiali) come segue:
      1. Strato 15 mL di coltura cellulare sopra 13 mL della soluzione di diatrizoato polisaccaride-sodio.
      2. Centrifugare per 1.250 × g per 20 min a RT con accelerazione e deaccelerazione minime. Raccogliere lo strato cellulare (nuvola) nell'interfaccia tra il terreno e la soluzione di diatrizoato di polisaccaride-sodio.
      3. Lavare le cellule almeno due volte con un terreno di coltura Synaptic Transfer Preriscaldato (preparato al punto 1.2.7).
      4. Contare e risospendere le cellule fino a una concentrazione finale di 2,5 × 10⁶/mL utilizzando un mezzo di saggio a trasferimento sinaptico. Cocoltura di 100 μl di questa sospensione cellulare con BSLB (vedere la fase 1.2.15).
   10. Calcolare il numero di BSLB necessari per l'esperimento; considerare tutte le diverse master mix proteiche e le titolazioni di antigeni da testare (monomeri biotinilati HLA/MHC-peptidi o monobiotinilati anti-CD3ε Fab).
   11. Assemblare i BSLB seguendo gli stessi passaggi della sezione 5 del protocollo, ma questa volta combinare tutte le titolazioni di proteine e lipidi necessarie per ricostituire una membrana APC complessa (Figura 3A). Mantenere le stesse relazioni vol: vol tra il volume iniziale delle perle di silice e il volume della miscela proteica utilizzata durante le calibrazioni, nonché i tempi e le temperature utilizzati nel caricamento dei BSLB. Ad esempio, se per la calibrazione iniziale sono stati utilizzati 0,5 μL di perle di silice/pozzetto e 100 μL/pozzetto di miscela proteica, mantenere rapporti 5:1.000 vol:vol per preparare i BSLB da cocoltivare con le cellule T.
   12. Una volta che i BSLB sono stati caricati con il mix proteico di interesse, lavarli due volte con HBS/HSA (BSA) per rimuovere le proteine non legate in eccesso. Utilizzare velocità di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT in ogni fase di lavaggio ed eliminare i surnatanti.
   13. Risospendere i 5 × 105 BSLB per pozzetto in 200 μL.
   14. Trasferire 100 μl per pozzetto in una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U per creare un duplicato, in modo tale che la quantità finale di BSLB per pozzetto sia 2,5 × 10⁵.
   15. Centrifugare i BSLB a 300 × g per 2 minuti e RT e scartare il surnatante.
   16. Risospendere i BSLB utilizzando 100 μL di sospensione di cellule T; mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle.
   17. Incubare le cocolture per 90 minuti a 37 °C.
       nota: In alternativa, le cellule e le perle possono essere risospese in tampone HBS/HSA (BSA) invece che in RPMI senza rosso fenolo per la cocoltura. In questo caso, l'incubazione deve essere eseguita in un incubatore non CO₂ in quanto questo gas acidifica rapidamente il tampone in assenza di bicarbonato.
   18. Raffreddare le cocolture di cellule BSLB-T incubando prima le cellule a RT per un minimo di 15 minuti. Proteggerle dalla luce.
   19. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 × g e RT; scartare il surnatante.
   20. Risospendere le cellule in RT 2% BSA-PBS (Ca₂⁺ e Mg₂⁺-free) per il blocco. Mettere le celle sul ghiaccio per 45 min. Proteggere dalla luce.
   21. Durante l'incubazione delle cellule, preparare la miscela master di anticorpi utilizzando 2% BSA in PBS filtrato a freddo da 0,22 μm come tampone di colorazione, che fornirà un ulteriore blocco.
       nota: Alcuni lotti di anticorpi coniugati ai coloranti Brilliant Violet tendono a legarsi ai BSLB in modo non specifico. Il blocco con il 5% di BSA-PBS aiuta a ridurre questo rumore. D'ora in poi, assicurati di mantenere ininterrotta la catena del freddo.
   22. Centrifugare le cocolture a 500 × g per 5 min e 4 °C. Prima di scartare i surnatanti, assicurarsi brevemente che il pellet sia presente ispezionando il fondo della piastra a 96 pozzetti utilizzando una retroilluminazione.
   23. Utilizzando una pipetta multicanale, risospendere le cellule nella miscela master di colorazione contenente concentrazioni di anticorpi ottimizzate.
       nota: Utilizzare puntali per pipette senza filtro per evitare la generazione di bolle ed errori nella distribuzione dei volumi di colorazione.
   24. Includere cellule marcate con isotipo e BSLB, BSLB fluorescenti e non fluorescenti e cellule e BSLB colorati da soli. Rispettare il numero totale di eventi per pozzetto per tutti i controlli (ad esempio, solo BSLB contenenti 5 × 10⁵ BSLB/pozzetto e solo controlli cellulari contenenti 5 × 10⁵ cellule/pozzetto per evitare un aumento relativo degli anticorpi per evento colorato).
   25. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume e incubare per 30 minuti con ghiaccio. Proteggere dalla luce.
   26. Lavare le cellule e i BSLB due volte utilizzando BSA-PBS al 2% ghiacciato, pH 7,4 e fasi di sedimentazione di 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cocolture lavate in 100 μL di PBS e acquisire immediatamente.
   27. Se è necessaria la fissazione, fissare utilizzando lo 0,5% p/v di PFA in PBS per 10 minuti, lavare una volta e conservare in PBS fino all'acquisizione. Proteggere dalla luce.
   28. Prima di compensare, acquisire gli standard MESF, assicurandosi che sia le popolazioni più deboli che quelle più luminose rientrino nell'intervallo lineare di misurazione.
   29. Acquisire campioni di compensazione, calcolare la compensazione e applicare la matrice di compensazione (collegamento) all'esperimento.
   30. Acquisisci e salva un minimo di 2 × 10⁴ standard MESF totali per ciascuno dei canali di quantificazione.
   31. Per l'acquisizione con campionatori ad alta produttività, impostare l'acquisizione dello strumento su standard, impostare l'acquisizione del campione su 80 μl (o 80% del volume totale), velocità di flusso del campione compresa tra 2,0 e 3,0 μl/s, volume di miscelazione del campione di 50 μl (o 50% del volume totale per evitare la formazione di bolle durante la miscelazione), miscelazione del campione di 150 μl/s, e miscelazione per pozzetto tra 3 e 5.
   32. Acquisire un minimo di 1 × 10⁴ singoli BSLB per campione (fare riferimento ai pannelli Figure 3B (i)-(vi) per la strategia di gating di riferimento).
   33. Lavare il citometro per 5 minuti con una soluzione detergente seguita da 5 minuti di acqua ultrapura prima di spegnere lo strumento. Se si utilizza l'HTS, seguire le opzioni nella scheda HTS e l'opzione Pulisci.
   34. Esporta i file FCS.

3. Misurare il trasferimento sinaptico di particelle ai BSLB

1. Apri i file FCS dell'esperimento. Selezionare la popolazione di cellule e BSLB in base alle loro aree di diffusione della luce laterale e anteriore (SSC-A rispetto a FSC-A), come mostrato nella Figura 3B (i).
2. Selezionare gli eventi all'interno della finestra di acquisizione continua (Figura 3B (ii)).
3. Concentrarsi sui singoli eventi di entrambe le celle e BSLB; identificare prima le singole celle in base al basso W nelle porte sequenziali FSC-W/FSC-H (singoletto-1, Figura 3B pannello (iii)) e SSC-W/SSC-H (singoletto-2; Figura 3B pannello (iv)). Definire un gate singoletto 3 aggiuntivo selezionando gli eventi con FSC-A e FSC-H proporzionali (Figura 3B, pannello (v)).
4. Estrarre l'MFI delle frazioni MESF in bianco e da 1 a 4 e da singole cellule e MESF per ogni campione dell'esperimento.
5. Genera valori MFI corretti (cMFI) per le frazioni MESF da 1 a 4 sottraendo l'MFI della popolazione di perline vuote da ciascuna frazione.
6. Generare cMFI per singoli BSLB e celle (fare riferimento alla Figura 3C pannello (i)).
7. Utilizzare il segnale di BSLB colorato con anticorpi di controllo dell'isotipo per correggere l'MFI di BSLB colorato con anticorpi contro i marcatori delle cellule T pertinenti. Utilizzare cMFI per calcolare la percentuale di trasferimento sinaptico normalizzato (NST%) utilizzando l'equazione mostrata nel pannello (ii) della Figura 3C.
8. Se invece interessati alle particelle specificamente trasferite in risposta all'innesco del TCR, sottrarre il segnale dai BSLB nulli dall'MFI dei BSLB agonistici. Utilizzare questo cMFI per calcolare l'NST% guidato dal TCR utilizzando l'equazione mostrata nel pannello (ii) della Figura 3C.
9. Se interessati a determinare il numero totale di molecole trasferite come carico di particelle attraverso l'interfaccia cellula T-BSLB, è possibile acquisire le perle di benchmark MESF utilizzando le stesse impostazioni dello strumento e la stessa sessione di acquisizione per le cocolture di cellule T-BSLB.
10. Analizza le popolazioni di perline MESF ed estrai le loro cMFI. Calcolare la pendenza della linea di best fit per l'analisi di regressione di MESF su cMFI.
11. Utilizzare la pendenza calcolata per estrarre il numero di MESF depositati sui BSLB. Utilizzare le cMFI calcolate utilizzando i controlli isotipici o i BSLB nulli come spazi vuoti per estrarre il numero di MESF trasferiti specificamente ai BSLB stimolanti.
12. Calcolare il numero di molecole di marcatori trasferiti ai BSLB dividendo i MESF calcolati (medi) per BSLB per il valore F/P dell'anticorpo di quantificazione.

Risultati

Figura 1: Quantificazione assoluta delle proteine sulla superficie delle APC. (A) Esempio di misure di citometria a flusso quantitativa di ICAM-1 sulla superficie di cellule B tonsillari (Foll. Bc) e cellule T helper (TFH). (I-VII) Strategia di gating per l'analisi di singoli CXCR5+ Bc e TFH isolati da tonsille palatine umane. Viene mostrata la strategia di gating se...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di cultura cellulare a 96 pozzetti con fondo a U con coperchio, coltura tissutale trattata, apirogena	Costar®	Telefono 3799	Per la colorazione FCM e la co-coltura di BSLB e cellule.
Piastra di cultura cellulare a 96 pozzetti, fondo a V con coperchio, coltura tissutale trattata, apirogena.	Costar®	3894	Per la colorazione FCM di cellule o perline in sospensione.
Alexa Fluor 488 NHS Estere (Succinimidil Estere)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Estere (Succinimidil Estere)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 e A20006
Multipozzetto 6 pozzetti Coltura tissutale trattata con plasma gassoso sottovuoto	Falcone	353046	Per la coltura e l'espansione di cellule T CD4+ e CD8+ purificate.
Caseina da latte bovino, adatta come substrato per protein chinasi (dopo defosforilazione), polvere purificata
Dynabeads Attivatore T Umano CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	Codice 11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	Codice 12321D	Per la rimozione del T-Activator umano CD3/CD28 di Dynabeads in volumi inferiori a 2 mL
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	Codice 12301D	Per la rimozione del T-Activator umano CD3/CD28 di Dynabeads™ in volumi inferiori a 15 mL
Siero bovino fetale qualificato, uno sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Necessita di inattivazione termica per 30 min a 56 oC
anti-umano CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLeggenda	310815 e 310818	Coniugati Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, rispettivamente
Criceto Armeno IgG Alexa Fluor 647 Controllo isotipico, clone HTK888	BioLeggenda	400902	Etichettato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Citometro BD Setup e Tracking Beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track degli strumenti prima della MCA quantitativa