Il seguente metodo è adattato per testare ceppi concorrenti con ceppi produttori di inibitori.
NOTA: Questo protocollo prevede la generazione di aerosol con colture batteriche. Questa operazione può essere eseguita solo in uno spazio confinato con l'implementazione di considerazioni di sicurezza approvate a livello locale. L'irrorazione della coltura sulle piastre di agar all'interno di una cabina di sicurezza di livello 2 ridurrà al minimo la contaminazione delle piastre di agar e dell'ambiente circostante. Ciò proteggerà anche il ricercatore dall'inalazione di aerosol dei batteri spruzzati, questa è una delle principali preoccupazioni se il ricercatore utilizza organismi di livello di contenimento 2. È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati. L'area circostante la capsula di Petri è meglio coperta con un tessuto assorbente monouso. Si consiglia la decontaminazione post-spray con luce UV.
1. Preparare le Piastre di Agar
- Preparare l'agar per infusione cerebrale e cardiaca (BHI) secondo le istruzioni del produttore.
- Autoclavare l'agar BHI a 121 °C, 15 libbre-forza per pollice quadrato (psi) per 20 minuti, o secondo le raccomandazioni del produttore dell'autoclave, per sterilizzare.
- Versare 15 ml di aliquote di agar BHI sterilizzato in piastre di Petri sterili e lasciarlo solidificare.
nota: Assicurarsi che ogni piastra di agar da utilizzare all'interno del test provenga dallo stesso stock di agar e che vi sia la stessa quantità di agar in ciascuna piastra. Ciò limita la variabilità dei nutrienti disponibili e la diffusione degli inibitori tra le piastre, consentendo la comparabilità.
2. Preparare il Brodo Sterile
- Preparare il brodo BHI secondo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 10 ml di aliquote di BHI ai flaconi universali in vetro da 28 ml.
- Sterilizzare in autoclave il brodo BHI a 121 °C, 15 psi per 20 minuti, o secondo le raccomandazioni del produttore dell'autoclave.
nota: Assicurarsi che tutto il brodo utilizzato nel test provenga dallo stesso lotto di brodo autoclavato nello stesso momento per limitare la variazione dei nutrienti che potrebbe causare variazioni nei risultati.
3. Preparazione del flacone sterile del vaporizzatore
- Smontare il flacone del vaporizzatore.
- Spruzzare il 5% di detergente tensioattivo attraverso il vaporizzatore per eliminare i contaminanti interni e immergere il flacone, il coperchio e il vaporizzatore nel detergente tensioattivo al 5% per una notte.
nota: Quando si maneggiano i detergenti tensioattivi, è necessario utilizzare guanti e dispositivi di protezione individuale adeguati.
- Asciugare il vaporizzatore, il coperchio e le bottiglie sotto una cappa sterile per il flusso d'aria.
- Riempi il flacone con etanolo al 70%, ricollega il vaporizzatore e spruzza un po' di etanolo attraverso il vaporizzatore.
- Metti il coperchio sul vaporizzatore e conserva l'etanolo all'interno fino all'uso.
- Immediatamente prima dell'uso, sciacquare asetticamente il flacone con brodo BHI sterile e spruzzare il brodo attraverso il vaporizzatore.
nota: Ciò impedisce all'etanolo di influenzare l'inoculo aggiunto al flacone nel paragrafo 6.3.
4. Preparazione delle colture batteriche notturne
- Strisciare i ceppi concorrenti e inibitori su una piastra sterile di agar BHI e incubare a 37 °C aerobicamente per circa 18 ore (durante la notte).
nota: Questa piastra produce una scorta di batteri che può essere utilizzata per più repliche nell'arco della stessa settimana se conservata a 4 °C.
- Inoculare 10 ml di brodo BHI sterile con una singola colonia del ceppo batterico concorrente richiesto all'interno di un flacone universale da 28 ml.
- Incubare il flacone universale a 37 °C aerobicamente per una notte agitando a 250 giri/min in un agitatore orbitale.
5. Coltura spot dell'isolato produttore di inibitori
- Preparare le colture notturne come descritto nella sezione 4.
- Assicurarsi che le piastre di agar siano completamente asciutte, senza condensa sul coperchio, prima dell'inoculazione (ad esempio incubando la piastra per 60 minuti a 37 °C); ciò impedisce all'inoculo di diffondersi attraverso la piastra dal sito di inoculazione.
- Pipettare 25 μl della coltura notturna al centro delle piastre di agar. Evitare di premere completamente lo stantuffo della pipetta per evitare bolle d'aria che spruzzano la coltura sull'agar.
- Lasciare asciugare la coltura a temperatura ambiente per limitare la diffusione della coltura. Incubare le piastre di agar agar a 37 °C in modo aerobico per una notte.
6. Preparazione dell'inoculo spray del ceppo concorrente di prova
- Preparare la coltura notturna come descritto nella sezione 4. Diluire la coltura notturna 10 volte in brodo BHI per ottenere circa 4 x 106 unità formanti colonie (CFU) ml-1 e una sospensione di OD600 0,3 ±0,05.
nota: Una diluizione di 10 volte non darà 4 x 106 CFU ml-1 per tutte le specie batteriche, calcolare il fattore di diluizione necessario distribuendo le diluizioni seriali di placcatura tra 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Versare la coltura diluita in un flacone di vaporizzatore di profumo di plastica sterile.
nota: Il volume totale deve essere superiore a quello necessario per il numero di piastre di agar da spruzzare. Circa 250 μl per piastra sono adatti per una piastra di Petri di 9 cm di diametro.
7. Saggio di inibizione della crescita differita
- Spruzzare la coltura attraverso ciascuno dei flaconi del vaporizzatore per assicurarsi che la coltura sia caricata nel meccanismo di spruzzatura prima di spruzzare sull'agar.
- Da una distanza di circa 15 cm sopra l'agar, spruzzare circa 250 μl di coltura diluita (3 spruzzi di un tipico vaporizzatore da 50 ml) su tutta la superficie dell'agar. Incubare le piastre di agar agar a 37 °C in modo aerobico per una notte. Ripetere per altre piastre con lo stesso numero di spruzzi.
8. Interpretazione dei risultati del saggio di inibizione della crescita differita
- Misurare la zona di inibizione della crescita del ceppo concorrente irrorato (Figura 1A-C, da "X" a "X") in millimetri, sottraendo il diametro del punto centrale dell'inibitore-produttore (Figura 1A-C, da "Y" a "Y").
NOTA: La Figura 1E mostra come questi dati potrebbero essere presentati
- Registra il punteggio di chiarezza per le zone di inibizione.
nota: Questo indica il grado di inibizione osservato. Gli esempi sono mostrati nella Figura 1A-D, i ceppi che possono essere utilizzati per la standardizzazione sono suggeriti nella sezione dei risultati rappresentativi. La seguente scala può essere utilizzata per il punteggio di chiarezza: un punteggio di chiarezza di 0 per descrivere una zona di completa inibizione della crescita del ceppo concorrente. Un punteggio di 1 descrive una zona di inibizione quasi completa della crescita, con solo singole colonie presenti nella zona di radura. Un punteggio di 2 descrive una zona visibile di crescita ridotta, la crescita all'interno di questa zona è confluente o quasi confluente ma ridotta in densità del >50%. Un punteggio di 3 descrive solo una riduzione minima della crescita, la crescita è confluente e ridotta di meno del 50% e una zona è ancora visibile e misurabile. Un punteggio di 4 non descrive alcuna inibizione visibile della crescita. Un punteggio di 5 descrive che la crescita del ceppo concorrente è aumentata in prossimità del ceppo produttore dell'inibitore del test. Vedere la Figura 1 per esempi. Questi punteggi sono soggettivi per lo sperimentatore.
