Un test per quantificare la salmonella citosolica e vacuolare nei macrofagi primari infetti

In questo articolo

Abstract

Fonte: Meunier, E., et al. Quantificazione della salmonella citosolica rispetto a quella vacuolare nei macrofagi primari mediante permeabilizzazione differenziale. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra un test per quantificare la Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare all'interno di macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale. I macrofagi sono infettati da una proteina fluorescente che esprime Salmonella, che viene internalizzata all'interno di una struttura vacuolare specializzata chiamata vacuolo contenente Salmonella o SCV. Un sottogruppo di batteri sfugge all'SCV ed entra nel citosol. La membrana plasmatica ricca di colesterolo dei macrofagi viene permeabilizzata utilizzando la digitonina, lasciando intatto l'SCV. Dopo aver marcato i batteri citosolici con un anticorpo marcato in fluorescenza, la percentuale di batteri vacuolari e citosolici viene quantificata utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Protocollo

1. Saggio della digitonina con Salmonella che esprime mCherry (analisi basata su FACS)

Preparazione batteri
Nota: in questo test viene utilizzato Salmonella wild-type SL1344 (resistente alla streptomicina) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV che codifica per mCherry sotto il promotore rpsM). La fagocitosi e la proliferazione batterica non sono state alterate dall'espressione costitutiva di mCherry (dati non mostrati).
1. Inoculare il ceppo 1 giorno prima dell'infezione in 3 ml di terreno LB integrato con streptomicina (90 μg/ml) e ampicillina (100 μg/ml, vettore che esprime mCherry) ....

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Risultati

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Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo 1. Le cellule infette contenenti Salmonella mCherry-positiva, sia nei vacuoli intatti che nel citosol, sono permeabilizzate in modo differenziale con digitonina. Le Salmonelle citosoliche sono colorate con anti-Salmonella accoppiate a FITC. Le cellule vengono lavate e lisate con Triton X-100 per l'analisi FACS. Le cellule.......