Un test per quantificare la salmonella citosolica e vacuolare nei macrofagi primari infetti

Abstract

Fonte: Meunier, E., et al. Quantificazione della salmonella citosolica rispetto a quella vacuolare nei macrofagi primari mediante permeabilizzazione differenziale. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra un test per quantificare la Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare all'interno di macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale. I macrofagi sono infettati da una proteina fluorescente che esprime Salmonella, che viene internalizzata all'interno di una struttura vacuolare specializzata chiamata vacuolo contenente Salmonella o SCV. Un sottogruppo di batteri sfugge all'SCV ed entra nel citosol. La membrana plasmatica ricca di colesterolo dei macrofagi viene permeabilizzata utilizzando la digitonina, lasciando intatto l'SCV. Dopo aver marcato i batteri citosolici con un anticorpo marcato in fluorescenza, la percentuale di batteri vacuolari e citosolici viene quantificata utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Protocollo

1. Saggio della digitonina con Salmonella che esprime mCherry (analisi basata su FACS)

1. Preparazione batteri
   Nota: in questo test viene utilizzato Salmonella wild-type SL1344 (resistente alla streptomicina) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV che codifica per mCherry sotto il promotore rpsM). La fagocitosi e la proliferazione batterica non sono state alterate dall'espressione costitutiva di mCherry (dati non mostrati).
   1. Inoculare il ceppo 1 giorno prima dell'infezione in 3 ml di terreno LB integrato con streptomicina (90 μg/ml) e ampicillina (100 μg/ml, vettore che esprime mCherry) in uno shaker a 37 °C O/N.
2. Cellule di placcatura per l'infezione.
   1. Seme di BMDM wild-type in una piastra a 24 pozzetti a una densità di 1,25 x 10⁵ cellule/pozzetto in 1 ml di terreno macrofagico primario (DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS, inattivato termicamente, 56 °C, 30 min), acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico all'1% (HEPES), 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1% di L-glutammina e 10% di surnatante L929 (terreno condizionato da fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) che produce cellule L929). I pozzetti di semina secondo la Tabella 1 tengono conto delle condizioni individuali. Aggiungere vetrini coprioggetti ai pozzetti utilizzati come controlli (Tabella 1).
   2. Incubare le cellule per una notte in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Preparare i batteri per l'infezione.
   1. Il giorno successivo, determinare la concentrazione di Salmonella nella coltura notturna diluendo la coltura 1:10 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e misurando l'OD₆₀₀ rispetto a un controllo solo PBS. Ciò garantisce che l'OD₆₀₀ venga misurato nell'intervallo lineare dello spettrofotometro.
   2. Calcola la concentrazione di Salmonella per ml. Un OD₆₀₀ di 1 corrisponde a 1 x 10⁹ batteri.
   3. Diluire i batteri in un mezzo macrofagico per raggiungere una concentrazione di Salmonella di 1,25 x 10⁶ cellule/ml.
4. Infezione delle cellule con Salmonella.
   1. Rimuovere il terreno dai BMDM. Aggiungere 1 ml di terreno macrofagico ai pozzetti di controllo non infetti (B1-B3, C1-C3). Aggiungere 1 ml di sospensione di Salmonella ai pozzetti A1 - A5 per raggiungere una molteplicità di infezioni (m.o.i.) di 10 batteri per cellula.
   2. Centrifugare la piastra per 15 minuti a 300 x g a 37 °C per sincronizzare l'infezione. Trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂.
5. Uccidere la Salmonella extracellulare con la gentamicina.
   1. A 1 ora dall'infezione, rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 0,1 ml di terreno macrofagico contenente 0,1 mg/ml di gentamicina per uccidere i batteri extracellulari. Aggiungere la gentamicina a tutti i pozzetti, anche ai controlli non infetti, per garantire che tutte le cellule siano trattate allo stesso modo. Trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Lavaggio delle celle.
   1. A 2 ore dall'infezione, rimuovere la piastra dall'incubatore e lavare tutti i pozzetti 2 volte con 1 ml di DMEM semplice (preriscaldato a 37 °C) e sostituirlo con un terreno macrofagico (preriscaldato a 37 °C) contenente 10 μg/ml di gentamicina per prevenire la crescita di eventuali batteri extracellulari rimanenti. Trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂.
7. Preparazione di tamponi freschi con detergenti e anticorpi.
   1. Poco prima del momento desiderato per l'analisi, preparare una soluzione madre fresca di digitonina a 1 mg/ml in tampone KHM (110 mM di acetato di potassio, 20 mM di HEPES, 2 mM di MgCl₂, pH 7,3). Filtrare il brodo e diluirlo in tampone KHM fino a una concentrazione di lavoro di 50 μg/ml di digitonina. Inoltre, preparare una soluzione di saponina allo 0,1% in tampone KHM, anticorpo anti-Salmonella accoppiato a fluoresceina isotiocianato (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexina a 1/100 o anti-proteina disolfuro isomerasi (anti-PDI) a 1/100 in tampone KHM integrato con albumina sierica bovina (BSA) al 3%.
8. Permeabilizzazione cellulare.
   1. Estrarre la piastra dall'incubatore e lavare i pozzetti 3 volte con 0,5 ml di tampone KHM (preriscaldato a 37 °C). Rimuovere il tampone KHM e aggiungere 0,25 ml di tampone KHM semplice ai pozzetti A4 e B1/C1, tampone KHM con digitonina ai pozzetti A1 - A3 e B2/C2 o tampone KHM con saponina ai pozzetti A5 e B3/C3 (secondo la Tabella 1). Incubare per esattamente 1 minuto a RT e lavare immediatamente tutti i pozzetti 3 volte con 0,5 ml di tampone KHM (preriscaldato a 37 °C).
9. Colorazione primaria degli anticorpi.
   1. Rimuovere il tampone KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpi primari (Goat anti-Salmonella-FITC, 250 μl/pozzetto, 0,1 μg/ml) nei pozzetti appropriati (Figura 1, Tabella 1). Incubare la piastra per 15 minuti in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Lavare le cellule 1 volta con 1 mL di PBS.
10. Cellule infette (pozzetti A1 - A5): analisi FACS
    1. Lavare le celle 3 volte con PBS e aggiungere 0,5 ml di PBS ghiacciato contenente lo 0,1% di Triton. Trasferire in una provetta FACS da 5 mL con tappo del filtro cellulare per rompere gli aggregati cellulari. Conservare i campioni sul ghiaccio.
    2. Analizza i campioni di FACS. Utilizzando i controlli completamente permeabili, impostare prima il gate per i batteri totali in base alla diffusione diretta e laterale (FSC/SSC) e al segnale mCherry (610 nm ± filtro a 20 nm).
    3. Successivamente, analizzare il segnale FITC nella popolazione batterica totale utilizzando i controlli completamente permeabilizzati e non permeabilizzati per impostare i cancelli per i batteri citosolici (FITC+, mCherry+) e i batteri vacuolari (FITC-, mCherry+) (Figura 2).
    4. Con i cancelli impostati, analizza i campioni e determina la percentuale di batteri citosolici rispetto a quelli vacuolari utilizzando il software FlowJo secondo il protocollo del produttore.

Tabella 1: Schema di placcatura per macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) in un formato a 24 pozzetti per la successiva infezione da Salmonella, permeabilizzazione e colorazione.

		Permeabilizzazione		Colorazione
	Vetrino coprioggetti in vetro	Salmonella	Digitonina	saponina	anti-Salmonella	anti-Calnexina	anti-PDI
A1 (campione)	-/+*	+	+		+
A2 (campione)	-/+*	+	+		+
A3 (campione)	-/+*	+	+		+
A4 (nessun controllo di permeabilizzazione)	-/+*	+			+
A5 (controllo completo della permeabilizzazione)	-/+*	+		+	+
B1 (colorato per la calnexina)	+					+
B2 (colorato per la calnexina)	+		+			+
B3 (colorato per la calnexina)	+			+		+
C1 (colorato per PDI)	+						+
C2 (colorato per PDI)	+		+				+
C3 (colorato per PDI)	+			+			+

Risultati

Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo 1. Le cellule infette contenenti Salmonella mCherry-positiva, sia nei vacuoli intatti che nel citosol, sono permeabilizzate in modo differenziale con digitonina. Le Salmonelle citosoliche sono colorate con anti-Salmonella accoppiate a FITC. Le cellule vengono lavate e lisate con Triton X-100 per l'analisi FACS. Le cellule...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Digitonina	sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Tecnologie per la vita	Codice: 15630
Acetato di potassio	sigma	791733
MgCl2	sigma	Codice: M8266
Bsa	sigma	Codice A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexina	Enzo Scienze della Vita	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Scienze della Vita	SPA-890	1/100
saponina	sigma	Numero 47036
Supporto di montaggio Vectashield	Laboratori vettoriali	H-1200
Anticorpo anti coniglio-488	Sonde molecolari	A-11070	1/500
Gentamicina	Tecnologie per la vita	Codice: 15710-49	100ug/mL e 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
Pbs	Gibco	Codice: 20012-019
DMEM	sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	Tecnologie BD		di rilevamento mCherry 610 nm
FACS Fortessa	Tecnologie BD		di rilevamento FITC 530 nm