Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione del tampone per la raccolta del sangue umano e l'isolamento delle piastrine lavate
- Preparare una soluzione acquosa da 100 mL di acido-citrato-destrosio (ACD) sciogliendo 1,4 g di acido citrico monoidrato (C6H8O7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g di citrato trisodico diidrato (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) e 2 g di D(+)-glucosio anidro. Il pH della soluzione è di circa 4,5.
- Preparare le soluzioni stock per il buffer di Tyrode come segue
- Preparare la soluzione madre 1 sciogliendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl), 2 g di cloruro di potassio (KCl), 10 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 0,58 g di sodio diidrogeno fosfato monoidrato (NaH2PO4*H2O) in 500 mL di H2O distillato. Le rispettive concentrazioni finali sono 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Mantenere la soluzione a 4 °C.
- Preparare la soluzione madre 2 sciogliendo 10,15 g di dicloruro di magnesio esaidrato (MgCl2*6 H2O) (100 mM) in 500 ml di acqua distillata (H2O). Mantenere la soluzione a 4 °C.
- Preparare la soluzione madre 3 sciogliendo 10,95 g (100 mM) di cloruro di calcio esaidrato CaCl2*6 H2O in 500 mL di H2O distillato. Mantenere la soluzione a 4 °C.
- Preparare il tampone di Tyrode diluendo 2,5 mL di soluzione madre 1 in un volume finale di 50 mL con H2O distillato. Ciò corrisponde a concentrazioni finali di 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3 e 0,42 mM NaH2PO4*H2O. Regolare il pH a 7,35 e sterilizzare filtrando con filtri da 0,22 μm.
- Preparare il tampone 0,35% per l'albumina di Tyrode (tampone TA) diluendo 5 mL di soluzione madre 1, 1 mL di soluzione madre 2, 2 mL di soluzione madre 3, 0,5 mL di HEPES 1M, 1,8 mL di albumina sierica umana da 200 g/L e 0,1 g di D(+)-glucosio anidro in un volume finale di 100 mL di H2O distillato.
- Regolare il pH a 7,35 con acido cloridrico 1N (HCl) e impostare l'osmolarità a 295 mOsm/L aggiungendo H2O distillato (10% del volume totale). Le concentrazioni finali in questa soluzione sono 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH2PO4*H2O, 0,91 mM MgCl2*6 H2O, 1,82 mM CaCl2*6 H2O. Mantenere il tampone TA a 37 °C durante l'intero esperimento.
2. Raccolta del sangue
- Raccogliere 45-50 ml di sangue venoso, dalla vena antecubitale utilizzando un ago da 19 G e un laccio emostatico basso o assente, in provette da 50 ml contenenti l'anticoagulante ACD (1 volume di ACD per 6 volumi di sangue). Scartare i primi 1-2 ml di sangue per evitare la presenza di trombina e fattore tissutale.
- Dopo la raccolta, mescolare il sangue con l'ACD capovolgendo delicatamente la provetta. Incubare il campione per 10 minuti a 37 °C.
3. Preparazione delle piastrine lavate dall'uomo
- Preriscaldare la centrifuga a 37 °C. Tutte le fasi di centrifugazione riportate di seguito vengono eseguite a questa temperatura.
- Inviare il sangue raccolto in provette da 15 mL (5 mL per provetta) e centrifugare a 250 x g per 13 minuti per ottenere plasma ricco di piastrine, PRP.
nota: Questa fase di centrifugazione si traduce nella produzione di tre strati nel campione: 1) Lo strato superiore, composto da plasma, piastrine e una piccola frazione di globuli bianchi. 2) Lo strato intermedio, una porzione ricca di globuli bianchi. 3) Lo strato inferiore, che è composto essenzialmente da globuli rossi.
- Raccogliere il PRP pipettando accuratamente lo strato superiore in una nuova provetta da 15 ml per prevenire al massimo la contaminazione con globuli rossi e bianchi e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Centrifugare il PRP a 2.200 x g per 12 minuti (per 5 mL di PRP).
nota: Questa fase di centrifugazione deve essere eseguita con freno basso o senza freno.
- Rimuovere il surnatante (plasma povero di piastrine) e risospendere con cura il pellet con 10 mL di tampone TA contenente 2 μL/mL di eparina (5.000 U/mL) e 2,5 μL/mL di prostaciclina 25 μM (PGI2) utilizzando una pipetta Pasteur di plastica. Incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 2,5 μL/mL di prostaciclina-I2 25 μM (PGI2) e centrifugare per 8 minuti a 1.900 x g (con freno basso o senza freno).
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 5 mL di tampone TA contenente 2,5 μL/mL di 25 μM PGI2 utilizzando una pipetta di plastica Pasteur. Incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Durante il periodo di incubazione, pipettare 150 μL della sospensione piastrinica in una provetta da 1,5 mL e contare le piastrine, utilizzando un contatore di cellule automatizzato (che rileva le dimensioni delle cellule del sangue misurando le variazioni della resistenza alla corrente continua).
- Dopo 10 minuti di incubazione, aggiungere 2,5 μL/mL di 25 μM PGI2 alla sospensione piastrinica e centrifugare immediatamente a 1.900 x g per 8 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet a una concentrazione di 250.000 piastrine/μL con un volume adeguato di tampone TA (cioè se la conta cellulare è 500.000 per μL, risospendere in 10 mL di tampone TA) contenente 32 μL/mL di apirasi a 0,01 U/mL (concentrazione finale 0,32 U/mL).
nota: Un'alta concentrazione di apirasi viene utilizzata per evitare la desensibilizzazione del purinocettore P2X 1, recettori P2X1 indotta dalla secrezione spontanea di adenosina trifosfato (ATP) in assenza di agonisti. Questo è importante perché le risposte indotte dal collagene sono indotte dalla rapida attivazione paracrina/autocrina di P2X1 da parte dell'ATP rilasciato dalle piastrine attivate. Se la via di segnalazione piastrinica non richiede in modo critico la conservazione della funzione P2X1, utilizzare 0,02 U/mL di apirasi. Diversi studi hanno dimostrato che 0,02 U/mL di apirasi evita l'adenosina difosfato, il recettore ADP P2Y, il purinocettore 1 e la desensibilizzazione P2Y1 con risposte P2X1 trascurabili.
- Incubare la sospensione cellulare per almeno 30 minuti a 37 °C prima di eseguire le misurazioni aggregometriche. La preparazione è stabile da 5 a 8 ore.
4. Aggregometria
- Preparare il fibrinogeno (56 mg/mL) nel tampone di Tyrode.
- Pipettare 260 μL di sospensione piastrinica in cuvette di vetro (Figura 1A; cuvetta sinistra) contenenti 10 μL di fibrinogeno (56 mg/mL) e un'asta di agitazione magnetica, quindi incubare la sospensione per 2 - 3 minuti a 37 °C nei pozzetti di incubazione presenti nell'aggregometro (Figura 1B e 1C).
- Pre-incubare con l'inibitore di Panx1 Brilliant Blue FCF aggiungendo 10 μl di una soluzione madre da 2,8 mM o 28 mM (concentrazione finale rispettivamente di 100 μM e 1 mM) per 7 minuti a 37 °C.
- Calibrare l'aggregometro su un valore di aggregazione presuntivo del 100% misurando la densità ottica (OD) di una cuvetta contenente 10 μL di fibrinogeno (56 mg/mL), 10 μL di Brilliant Blue FCF (2,8 mM o 28 mM) e tampone TA senza piastrine.
- Posizionare la cuvetta in un pozzetto di aggregazione sotto agitazione automatica e premere il pulsante corrispondente sulla tastiera del computer collegato all'aggregometro (cioè premere F1 se si utilizza il pozzetto di aggregazione 1).
nota: Questo esperimento descritto di seguito include Brilliant Blue FCF. Il composto utilizzato per la calibrazione deve essere adattato alle condizioni sperimentali.
- Calibrare l'aggregometro su un valore di aggregazione presuntivo dello 0% utilizzando lo stesso campione di piastrine che verrà utilizzato per l'esperimento con agitazione automatica.
- Posizionare la cuvetta nel pozzetto di aggregazione e premere il pulsante corrispondente sulla tastiera del computer collegato all'aggregometro. Attendere circa 20-30 s prima di procedere. Questo ritardo serve a garantire che non si verifichi alcuna aggregazione prima di aggiungere gli agonisti.
nota: Poiché qualsiasi differenza nel numero di piastrine può avere un effetto sul diametro esterno misurato, la fase di calibrazione 0% deve essere ripetuta per ogni singola misurazione.
- Aggiungere 20 μL di agonista desiderato, come 15 μg/mL di collagene (1 μg/mL finale) o 1,125 mM di acido arachidonico (75 μM finale), nella cuvetta. Avviare immediatamente la registrazione in agitazione automatica continua premendo il pulsante corrispondente sulla tastiera del computer collegato all'aggregometro.
nota: L'aggiunta dell'agonista induce l'attivazione piastrinica. Gli aggregati piastrinici possono essere chiaramente distinti nella cuvetta di vetro alla fine dell'esperimento (Figura 1A; cuvetta destra).
- La registrazione si interrompe automaticamente dopo 6 min. A questo punto, salva i dati cliccando sull'icona di salvataggio presente sul computer.
nota: Il calcolo del tasso di aggregazione viene eseguito dal computer, che esprime i risultati finali del processo di aggregazione in percentuale.
