NOTA: Tutte le fasi descritte nelle sezioni 1 e 2 vengono eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.
1. Manutenzione di U87. Cellule CD4.hCXCR4
- Coltivare le cellule in fiasche di coltura T75 a 37°C e 5% di CO2 in un incubatore umidificato.
nota: La linea cellulare in vitro utilizzata in questo protocollo è una linea cellulare di glioblastoma U87 che esprime stabilmente il cluster di differenziazione 4 (CD4) e il recettore umano delle chemochine CXC 4 (CXCR4) ed è stata precedentemente descritta. L'espressione della superficie cellulare di CD4 e CXCR4 è continuamente monitorata mediante citometria a flusso e i livelli di espressione rimangono costanti nel tempo (~ 100% CD4+ e ~ 100% cellule CXCR4+). Una descrizione dettagliata della generazione della linea cellulare utilizzata e della procedura di citometria a flusso per studiare i livelli di espressione dei recettori non rientra nell'ambito di questo protocollo.
- Cellule di subcoltura all'80-85% di confluenza. Lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (RT) prima della coltura cellulare.
- Rimuovere il terreno di coltura condizionato dalle cellule e lavare una volta il monostrato cellulare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 3 mL di acido tripsina-etilendiammina tetraacetico allo 0,25% (tripsina-EDTA) e distribuirlo uniformemente sul monostrato cellulare. Quindi rimuovere l'eccesso di tripsina-EDTA e incubare fino a 5 minuti a 37 °C fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
- Aggiungere 10 mL di terreno di crescita completo fresco (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% di siero fetale bovino (FBS) + 0,01 M di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) + agenti di selezione appropriati). Risospendere le cellule pipettandole delicatamente su e giù. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 50 mL.
- Conta il numero di celle vitali utilizzando un metodo a scelta. Nel caso delle cellule di glioblastoma U87, la vitalità raggiunge generalmente ~ 100%.
nota: Il numero di celle può essere determinato in diversi modi. Utilizziamo abitualmente un sistema automatizzato di analisi cellulare basato sulla colorazione con blu di tripano (vedi Tabella dei materiali) secondo le sue procedure di manipolazione standard, ma altri modi dovrebbero funzionare altrettanto bene.
- Aggiungere 2 x 106 o 3 x 106 cellule (vitali) a un volume finale di 25 mL di terreno di crescita fresco in un pallone di coltura T75 e incubare a 37 °C e 5% di anidride carbonica (CO2).
nota: Se si utilizzano 3 x 10,6 cellule, le celle raggiungeranno l'80-90% di confluenza dopo 2 giorni. Se si utilizzano 2 x 106 cellule, raggiungeranno la stessa confluenza dopo 3 giorni. Il tasso di crescita delle cellule dovrebbe essere prima determinato empiricamente se vengono utilizzate altre linee cellulari.
2. Semina delle cellule per il test di mobilizzazione del Ca2+
- Il giorno del passaggio delle cellule (giorno 0), rivestire le piastre a 96 pozzetti in polistirene a parete nera con fondo trasparente (vedere la Tabella dei materiali) con una soluzione di gelatina allo 0,1% per facilitare l'adesione delle cellule.
nota: Il rivestimento delle piastre a 96 pozzetti con gelatina potrebbe essere omesso se si utilizzano piastre pre-rivestite, disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali). Si raccomanda di valutare l'uso di piastre pre-rivestite invece del rivestimento manuale per ogni linea cellulare in esame prima di continuare con il protocollo.
- Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 1 g di gelatina a 100 ml di PBS per ottenere una soluzione all'1%. Diluire 10 volte con PBS prima di un ulteriore utilizzo. Per migliorare la solubilità della gelatina, riscaldare la soluzione a 37 °C.
- Aggiungere 100 μl di soluzione di gelatina allo 0,1% per pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per 2 ore a RT.
- Nel frattempo, preparare le celle per la semina nella piastra rivestita a 96 pozzetti.
- Staccare le cellule dal pallone di coltura, risospenderle nel terreno di coltura fresco e contarle utilizzando il metodo di colorazione con blu di tripano.
- Centrifugare le cellule in una provetta da 50 ml per 5 minuti a 400 x g a RT.
- Risospendere le cellule in un terreno di crescita fresco (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, senza antibiotici) per ottenere una densità cellulare di 0,1 x 106 cellule (vitali)/mL.
- Rimuovere la soluzione di gelatina dalle piastre con pareti nere con un fondo trasparente capovolgendo la piastra e asciugandola su un fazzoletto. Aggiungere 200 μL/pozzetto di PBS per rimuovere la gelatina in eccesso e capovolgere nuovamente la piastra.
- Erogare 200 μl di sospensione cellulare (corrispondenti a 0,2 x 105 cellule) per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di gelatina (d'ora in poi questa piastra sarà ulteriormente indicata come "piastra di misurazione").
- Incubare la piastra per una notte a 37 °C e 5% di anidride carbonica (CO2 ).
3. Caricamento delle celle con un colorante fluorescente sensibile al Ca2+
- Il giorno 1 eseguire il test di mobilizzazione del Ca2+ vero e proprio, iniziando con il caricamento delle cellule seminate con il colorante fluorescente legante il Ca2+ fluo-2 acetossimetile (fluo-2 AM).
- Preparare il tampone del saggio aggiungendo 40 mL di HEPES (1 M) a 200 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, 10x, senza rosso fenolo, senza bicarbonato di sodio). Aggiungere acqua ultrapura fino ad ottenere un volume finale di 2 L e aggiungere 4 g di albumina sierica bovina (BSA). Sciogliere il BSA mediante agitazione magnetica. Regolare il pH a 7,4 (con idrossido di sodio, NaOH) e filtrare la soluzione.
nota: Durante tutte le fasi successive viene utilizzato lo stesso tampone, denominato "tampone di saggio".
- Preparare una soluzione madre (4 mM in dimetilsolfossido (DMSO)) del colorante fluorescente sensibile al Ca2+ fluo-2 AM. Evitare un'eccessiva esposizione alla luce. Sciogliere 1 mg di fluo-2 AM (peso molecolare: 1.061 g/mol) in 235,6 μl di DMSO.
- Preparare una soluzione funzionante di fluo-2 AM. Per una piastra di saggio a 96 pozzetti, miscelare 12,5 μL di soluzione madre di fluo-2 AM (4 mM) e 12,5 μL di soluzione di poliolo tensioattivo non ionico (ad es. f-127 pluronico) (20% peso/volume in DMSO, vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere 22 μl di questa miscela a 11 mL di tampone per il saggio in una provetta da 15 mL. La concentrazione finale di fluo-2 AM è di 4 μM.
nota: Il tensioattivo non ionico viene utilizzato come agente di dispersione per migliorare la solubilità acquosa del fluo-2 AM e, di conseguenza, per aumentare il carico cellulare. Per solubilizzare il tensioattivo in DMSO, riscaldare il campione a 37 °C e mescolare regolarmente per ottenere una soluzione omogenea.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule precedentemente seminate nella piastra di misurazione a 96 pozzetti capovolgendo la piastra e asciugandola su un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 100 μl di soluzione colorante di carico per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 45 minuti a RT al buio.
4. Preparazione di piastre in polipropilene a 96 pozzetti contenenti il ligando delle chemochine CXC ligando delle chemochine 12 (CXCL12) o i composti in esame
- Ottenere piastre in polipropilene (PP) a fondo tondo a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali).
- Lasciare equilibrare la soluzione madre di CXCL12 (1 mg/mL) e la soluzione madre dei composti in esame a RT.
nota: La soluzione madre di CXCL12 è preparata in acqua ultrapura addizionata con lo 0,01% di Tween20 e conservata a -20 °C come aliquote monouso.
- Preparare una soluzione concentrata 5x di CXCL12 in tampone di saggio (250 ng/mL che equivale a 31,25 nM) e una diluizione concentrata 5x di ciascun composto (in tampone di saggio).
- Erogare le soluzioni madre nella piastra a 96 pozzetti appropriata secondo un layout di piastra predefinito. Erogare 75 μL/pozzetto nella piastra contenente CXCL12 (la "piastra per chemochine") e 50 μL/pozzetto nella piastra contenente i composti (la "piastra composta").
nota: Sia i composti che CXCL12 verranno infine diluiti 5 volte dopo l'erogazione nella piastra di misurazione. È anche importante includere pozzetti di controllo negativi contenenti solo tampone di saggio sia nella piastra composta che nella piastra per chemochine. Inoltre, devono essere inclusi pozzetti di controllo positivo (ad esempio, pozzetti con CXCL12 nella piastra di chemochine, ma con tampone di saggio nei pozzetti corrispondenti della piastra composta).
5. Impostazioni del protocollo sul lettore di micropiastre a fluorescenza
NOTA: Il lettore di micropiastre a fluorescenza utilizzato in questo protocollo è indicato nella Tabella dei Materiali.
- Accendere prima l'unità di raffreddamento del lettore di piastre a fluorescenza, quindi accendere il lettore di fluorescenza stesso. Avvia per qualche minuto e apri il software del sistema.
- Creare il protocollo del test utilizzando il menu drag-and-drop che include i seguenti passaggi:
- Nella casella "Impostazioni", selezionare 'Read_Mode' con lunghezza d'onda di eccitazione: 470-495 nM; e lunghezza d'onda di emissione: 515-575 nM.
nota: Le lunghezze d'onda selezionate sono adatte per l'uso con il colorante sensibile al Ca2+ fluo2.
- Includere la scatola "Mix with TF" (fluido di trasferimento) per la miscelazione automatica dei composti nella piastra del composto, che verrà posta alla fonte in 2 posizioni del dispositivo (vedere il passaggio 6.4). Selezionare 15 μL di soluzione in ciascun pozzetto da aspirare automaticamente e miscelare tre volte. Regolare l'altezza dei puntali della pipetta a 20 μl sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione e dispensazione a 50 μl/s.
nota: L'altezza dei puntali delle pipette si riferisce al volume che rimane sotto i puntali delle pipette. Ad esempio, se i pozzetti di una piastra composta contengono 50 μL, un'altezza di 30 μL corrisponde a 20 μL sotto la superficie del liquido. Il volume della soluzione composta prelevata per la miscelazione, la velocità di miscelazione, la posizione dei puntali delle pipette durante la miscelazione e il numero di cicli di miscelazione possono essere regolati utilizzando il software.
- Nella casella "Transfer Fluid", definire che 20 μl di ciascun pozzetto dalla piastra composta verranno trasferiti nella piastra di misurazione. Posizionare i puntali della pipetta a 20 μl sotto la superficie del liquido, ovvero a un'altezza di 30 μl durante l'aspirazione dei composti e a un'altezza di 60 μl durante l'erogazione nella piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 μL/s e la velocità di dispensazione a 25 μL/s.
nota: La piastra composta contiene 50 μL di soluzione per pozzetto (vedi passaggio 4.1.3), quindi un'altezza di 30 μL corrisponde a una posizione di 20 μL sotto la superficie del liquido. La piastra di misurazione conterrà 80 μl di tampone per pozzetto (vedere il passaggio 6.3), quindi un'altezza di 60 μl corrisponde a una posizione simile delle punte.
- Selezionare il pulsante "Leggi con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 60 letture (misurazioni fluorescenti) con un intervallo di lettura di 1 s. Definire che vengano registrate 10 letture prima di erogare i composti nella piastra di misurazione e 50 letture dopo. Definisce il secondo intervallo con un intervallo di lettura di 30 secondi e 18 letture.
nota: Durante questa fase, la fluorescenza sarà misurata cineticamente (agli intervalli di tempo definiti) per ~ 10 minuti in totale.
- Includi tre volte il pulsante "Suggerimenti per il lavaggio" nel protocollo. All'interno di ogni fase di lavaggio, selezionare il tipo di fluido: fluido A (acqua ultrapura) o fluido B (etanolo al 70%), il numero di cicli di lavaggio (1), la velocità della pompa (Veloce) e il numero di colpi (5) durante ogni fase di lavaggio.
nota: Durante la prima e l'ultima fase di lavaggio viene utilizzato il fluido A, durante la seconda fase di lavaggio viene utilizzato il fluido B.
- Includere la funzione "Metti in pausa pipettatore". Impostare il pipettatore in pausa per 300 s.
nota: Includendo questo passaggio nel protocollo, la testina del pipettatore, integrata nel dispositivo di lettura delle piastre a fluorescenza, si fermerà per 5 minuti prima di continuare il protocollo.
- Includere la casella "Mix with TF" per consentire la miscelazione automatica della soluzione CXCL12 nella piastra per chemochine, che verrà posizionata nella posizione sorgente 3 del dispositivo (vedere il passaggio 6.4). Selezionare 15 μL di soluzione in ciascun pozzetto da aspirare automaticamente e miscelare tre volte. Durante l'aspirazione e la miscelazione, posizionare i puntali della pipetta a 20 μl sotto la superficie del liquido. La velocità di aspirazione e dispensazione è fissata a 50 μL/s.
nota: Analogamente al passaggio 5.2.2, questi parametri possono essere regolati.
- Nella successiva casella "Transfer Fluid", definire che 25 μl da ciascun pozzetto della piastra per chemochine verranno trasferiti nella piastra di misurazione. Posizionare i puntali a 20 μl sotto la superficie del liquido, ovvero a un'altezza di 55 μl durante l'aspirazione dalla piastra di chemochine che contiene 75 μl/pozzetto (vedere il passaggio 4.1.3) e a un'altezza di 80 μl durante l'erogazione nella piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 μL/s e la velocità di dispensazione a 25 μL/s.
- Includi il pulsante "Leggi con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 145 letture con un intervallo di lettura di 1 s. Definire che vengano registrate 5 letture prima di erogare CXCL12 nella piastra di misurazione e 140 letture dopo. Definire il secondo intervallo con un tempo di intervallo di lettura di 6 s e selezionare 20 letture.
nota: Nel complesso, in tutto il protocollo vengono registrate 243 reads (misure fluorescenti): 78 al passaggio 5.2.4 e 165 durante il passaggio 5.2.9.
- Analogamente al passaggio 5.2.5, includere il pulsante "Suggerimenti per il lavaggio" tre volte nel protocol.
nota: L'inclusione di questo passaggio alla fine del protocollo consente di riutilizzare le punte per eseguire un altro test senza la necessità di cambiare le punte.
- Impostare la temperatura del dispositivo a 37 °C facendo clic sul pulsante "Imposta temperatura fase" e selezionando 37 °C.
6. Esecuzione del test di fluorescenza
- Dopo che la piastra di misurazione è stata incubata con il tampone di carico per 45 minuti (vedere punto 3.1.5), rimuovere il tampone capovolgendo la piastra e asciugarla su un fazzoletto.
- Lavare le cellule seminate aggiungendo 150 μL/pozzetto di tampone per il saggio e incubare per 2 minuti.
- Rimuovere nuovamente il tampone capovolgendo la piastra. Aggiungere 80 μL/pozzetto di tampone per saggi con una pipetta multicanale.
- Inserire tutte le piastre nel dispositivo nella posizione appropriata: la piastra composta nella posizione sorgente 2, la piastra per chemochine nella posizione sorgente 3 e la piastra di misurazione nella posizione di lettura. Metti una scatola di punte nere nella posizione delle punte 1 della fonte. Chiudere lo sportello del dispositivo e incubare per 5 minuti prima di continuare il protocollo.
- Selezionare il pulsante "Test del segnale di protocollo" per determinare le unità di luce relativa di fondo (RLU) e la varianza della fluorescenza sulla piastra. Apparirà una nuova finestra. Selezionare "Segnale di prova".
nota: Durante questa fase, le RLU di fondo sono determinate dalla fotocamera ICCD (Intensified Charge-Coupled Device), che è integrata nel compartimento ottico del lettore di fluorescenza. Questi RLU derivano dall'eccitazione del colorante sensibile al Ca2+ (fluo-2) da parte di diodi emettitori di luce (LED) (lunghezza d'onda di uscita del LED 470-495 nm). Valori di 8.000-10.000 RLU sono adatti per questa applicazione. Gli RLU possono, se necessario, essere adattati modificando l'intensità di eccitazione (Select Exc. Intensity) o il gate della telecamera (Select Gate Open). La varianza rispetto alla piastra dovrebbe idealmente essere inferiore al 7,5%.
- Selezionare "Aggiorna" se si ottengono valori di fondo di 8.000-10.000 RLU. Salvare il protocollo principale facendo clic sul pulsante Salva.
nota: In questo modo, le impostazioni del test del segnale di protocollo verranno trasferite al protocollo principale.
- Eseguire il test premendo il pulsante "RUN".
