Un saggio cellulare per l'identificazione di agenti che interagiscono con CXCR4

Abstract

Fonte: Claes, S. et al., Un test di mobilizzazione del Ca²⁺ basato sulla fluorescenza cinetica per identificare agonisti, antagonisti e modulatori allosterici del recettore accoppiati a proteine G.J. Vis. Exp.(2018)

Questo video illustra un test cellulare che coinvolge cellule di glioblastoma che esprimono recettori chemochine CXCR4. Il test impiega un colorante sensibile al calcio per misurare le variazioni di fluorescenza in seguito all'interazione con l'agente, offrendo informazioni sulle dinamiche di segnalazione cellulare.

Protocollo

NOTA: Tutte le fasi descritte nelle sezioni 1 e 2 vengono eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.

1. Manutenzione di U87. Cellule CD4.hCXCR4

1. Coltivare le cellule in fiasche di coltura T75 a 37°C e 5% di CO₂ in un incubatore umidificato.
   nota: La linea cellulare in vitro utilizzata in questo protocollo è una linea cellulare di glioblastoma U87 che esprime stabilmente il cluster di differenziazione 4 (CD4) e il recettore umano delle chemochine CXC 4 (CXCR4) ed è stata precedentemente descritta. L'espressione della superficie cellul....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	Colorante fluorescente sensibile al Ca2+
Pluronico F-127	sigma	P2443-250G	Acido pluronico
gelatina	sigma	G9391
AMD3100	sigma	A5602-5 mg compresse rivestite con film	Antagonista specifico di CXCR4
Maraviroc	gentile dono di AnorMed		Farmaco antiretrovirale, antagonista CCR5
Legante per chemochine CXCL12	PeproTech	300-28A
Legante per chemochine CCL5	PeproTech	300-06
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 10270-106
Albumina sierica bovina (BSA)	sigma	A1933-25G
Medium dell'aquila modificata di Dulbecco (DMEM)	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 41965-039
HBSS (10 x), calcio, magnesio, senza rosso fenolo	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 15630-056
tripsina-EDTA (0,25 %), rosso fenolo	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 25200-056
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 14190-094
Provette Falcon, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Pallone per coltura tissutale (T75)	Corning	353024
Piastra nera, 96 pozzetti, fondo trasparente, con coperchio	Costar/Fisher Scientific	10530753	Piastra di saggio (96 pozzetti), per semina cellulare
Lastre in polipropilene (PP)	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	Piastre utilizzate per preparare le piastre composte e le piastre per chemochine, fondo tondo
Sistema di screening cellulare ad alta produttività FLIPR Tetra	Dispositivi molecolari		Lettore di piastre fluorescente con testina pipettatore integrata e telecamera ICCD
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 nm	Dispositivi molecolari	Codice 0200-6128	Diodi emettitori di luce per l'eccitazione del colorante fluorescente sensibile al Ca2+
Filtro di emissione FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Dispositivi molecolari	Codice 0200-6203	Filtro di emissione compatibile con il colorante fluorescente
Testa FLIPR Tetra 96	Dispositivi molecolari	Codice 0310-4536	Testa pipettatore a 96 pozzetti, integrata nel lettore di piastre fluorescenti
ScreenWorks	Dispositivi molecolari		Pacchetto software utilizzato per l'analisi e la visualizzazione dei dati su FLIPR Tetra
Vi-CELL	Beckman Coulter		Analizzatore di vitalità cellulare
Corning CellBIND 96 pozzetti, fondo trasparente, micropiastre in polistirene nero, con coperchio, sterili	Corning	Telefono 3340	Piastre di analisi pre-rivestite a 96 pozzetti che possono rappresentare un'alternativa al rivestimento manuale della piastra di analisi.