1. Prelievo cellulare e misurazione dell'attività della α-galattosidasi A o della α-glucosidasi acida
- Raccolta di cellule
- Il giorno del raccolto, rimuovere le cellule dall'incubatrice e aspirare il terreno. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS con Ca2+ e Mg2+,
NOTA: Questo passaggio è fondamentale perché DGJ e DNJ sono potenti inibitori della α-galattosidasi e della α-glucosidasi, rispettivamente, e qualsiasi residuo invaliderebbe il test.
- Aggiungere 200 μl di acqua deionizzata direttamente sopra le celle. Sciacquare le cellule dalla piastra e trasferirle in una provetta di reazione da 1,5 mL.
2. Omogeneizzazione mediante congelamento e scongelamento
- Mettere i campioni in un apposito rack di schiuma e agitare per 5 s per rendere la lisi più efficiente. Mettere i campioni alternandoli in azoto liquido per 10 s e in un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino al completamento dello scongelamento (5 min).
- Ripetere questa procedura 5 volte e quindi centrifugare i campioni per 5 minuti a 10.000 x g. Conservare il surnatante e la pipetta in una nuova provetta di reazione.
3. Determinazione della concentrazione proteica mediante il saggio dell'acido bicinconninico (BCA)
- Preparare una nuova provetta per ogni campione contenente 40 μl di H2O deionizzato e aggiungere 10 μl del campione. Miscelare brevemente la soluzione agitando e trasferire 10 μl in una cavità di una piastra a 96 pozzetti (ogni campione in triplicato). Diluire una soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) da 2 mg/mL in H2O deionizzato come segue per ottenere una curva standard: 50 μL H2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Iniziare la reazione aggiungendo 200 μl di reagente BCA (reagente A e reagente B miscelati in rapporto 50:1) e incubare per 1 ora al buio a 37 °C con una leggera agitazione su un agitatore orbitale (300 giri/min). Misurare l'assorbanza a 560 nm in un lettore di piastre.
nota: I campioni contengono in genere tra 1 e 1,5 μg di proteine per μl.
4. Misurazione dell'attività enzimatica con substrati artificiali di 4-metilumbelliferile (4-MUG)
- Diluire la quantità calcolata di ciascun campione e pipettare in provette di reazione fresche da 1,5 mL per ottenere 0,05 (per la α-galattosidasi A) o 0,5 (per la α-glucosidasi) di soluzioni acide di proteine/μL. Agitare nuovamente i campioni per 5 s e pipettare 10 μl di questa diluizione in una piastra a 96 pozzetti (ogni campione in duplicato).
- Iniziare la reazione aggiungendo 20 μl della rispettiva soluzione di substrato:
Per la α-galattosidasi A: 2 mM 4-metilumbelliferil-α-D-galattopiranoside (4-MU-gal) in tampone citrato fosfato 0,06 M, pH 4,7,
Per la α-glucosidasi acida: 2 mM 4-metilumbelliferil α-D-glucopiranoside (4-MU-glu) in acetato di sodio 0,025 M, pH 4,0.
- Incubare le reazioni enzimatiche per 1 ora al buio a 37 °C con una leggera agitazione su un agitatore orbitale (300 giri/min). Terminare la reazione con l'aggiunta di 200 μL di tampone glicina-NaOH a pH 10,5 aggiustato a pH 10,5.
- Preparare una curva standard di 4-metilumbelliferone (4-MU) da un campione di 0,01 mg/mL come segue:
100 μL di H2O/ no 4-MU; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H2O/ 80 μL 4-MU; no H2O/ 100 μL 4-MU, pipettare 10 μL di ciascuna diluizione nella piastra a 96 pozzetti (in duplicati) e aggiungere 200 μL del tampone glicina-NaOH 1,0 M in ciascun pozzetto per regolare il volume e il pH.
- Misurare l'attività enzimatica in un lettore di fluorescenza dotato del set di filtri appropriato e analizzare i dati utilizzando il software appropriato per il dispositivo di lettura della fluorescenza.
nota: Entrambi i substrati di 4-MUG sono ridotti a 4-MU durante l'esposizione alla α-galattosidasi A o alla α-glucosidasi acida. Il 4-MU rilasciato è un fluorocromo, che può essere misurato a 360 e 465 nm come lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, rispettivamente, utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre.
