Valutazione dell'efficacia di un composto di test antivirale attraverso un test di inattivazione virale

1. Saggio di inattivazione virale

Nota: Esempi di periodo di incubazione e dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 1A. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testate anche aumentando il MOI/PFU.

1. Seminare le cellule Huh-7.5 in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10⁴ cellule per pozzetto) e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ O/N per ottenere un monostrato.
2. Incubare i composti in esame o i controlli (le concentrazioni finali sono: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; eparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) con le particelle di HCV a 37 °C (Figura 1A, "Lungo termine") in un rapporto 1:1. Ad esempio, a un inoculo virale da 100 μl contenente 1 x 104 FFU, aggiungere 100 μl di una diluizione di lavoro CHLA da 100 μM; questo produce il trattamento CHLA a una concentrazione finale di 50 μM.
3. Diluire la miscela virus-farmaco a una concentrazione "sub-terapeutica" (inefficace) dei composti in esame. Ad esempio, la concentrazione inefficace di CHLA e PUG contro l'HCV è di 1 μM31; pertanto, ciò richiede una diluizione di 50 volte della miscela virus-farmaco che può essere ottenuta con 9,8 ml di terreno basale (terreno di coltura cellulare con il 2% di FBS).
   Nota: La diluizione a concentrazione subterapeutica impedisce un'interazione significativa tra i composti in esame e la superficie della cellula ospite e consente di esaminare l'effetto del trattamento sui virioni liberi da cellule. Si noti che questa diluizione dipende dalla risposta alla dose antivirale dei composti in esame contro la particolare infezione virale e viene determinata prima di eseguire questo particolare test.
4. Per confronto, mescolare il virus con i composti in esame e diluire immediatamente (senza periodo di incubazione) a una concentrazione inferiore a quella terapeutica prima dell'infezione (Figura 1A, "A breve termine").
5. Aggiungere 100 μl della miscela diluita HCV-farmaco sul monostrato di cellule Huh-7.5 (la quantità di virus è ora di 1 x 10² FFU; MOI finale = 0,01) e incubare per 3 ore a 37 °C per consentire l'adsorbimento virale.
6. Dopo l'infezione, rimuovere l'inoculo diluito e lavare delicatamente i pozzetti con 200 μl di PBS due volte.
   nota: Eseguire i lavaggi delicatamente per evitare di sollevare le cellule.
7. Applicare 100 μl di terreno basale su ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 72 ore.
8. Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività della luciferasi.

Figura 1. Inattivazione delle infezioni virali da parte dei composti in esame CHLA e PUG. Diversi virus sono stati trattati con i composti in esame per un lungo periodo (incubati per 1,5 – 3 ore prima della titolazione; barre grigio chiaro) o per un breve periodo (immediatamente diluiti; barre grigio scuro) a 37 °C prima di una diluizione a concentrazione sub-terapeutica e successiva analisi dell'infezione sulle rispettive cellule ospiti. (A) Schemi dell'esperimento (mostrati a sinistra) con la concentrazione finale del virus (PFU/pozzetto o MOI), il periodo di incubazione a lungo termine del virus-farmaco (i) e il successivo tempo di incubazione (ii) indicati per ciascun virus nella tabella a destra. Le analisi per (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV e (F) RSV sono indicate in ogni pannello aggiuntivo. I risultati sono confrontati con il trattamento di controllo negativo DMSO per l'infezione virale e i dati mostrati sono le medie ± errori standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata rispetto al riferimento.