Un test di attacco virale per lo screening di composti antivirali

Abstract

Fonte: Tai, C. et al., Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp.(2015)

Questo video mostra un test di attaccamento virale per lo screening di composti antivirali. Utilizzando il virus dell'epatite C geneticamente modificato e la luciferasi, valuta gli effetti inibitori sull'attaccamento virale, come indicato dalla minore intensità della luce nei pozzetti co-trattati rispetto ai pozzetti trattati con il solo virus.

Protocollo

NOTA: Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono la coltura cellulare e l'infezione virale siano condotte in cappe di biosicurezza certificate che siano appropriate per il livello di biosicurezza dei campioni da manipolare. Ai fini della descrizione dei protocolli, il virus dell'epatite C (HCV) marcato con Gaussia luciferasi reporter viene utilizzato come virus modello. Nel contesto dei risultati rappresentativi, i composti acido chebulagico (CHLA) e punicalagina (PUG) sono utilizzati come antivirali candidati che mirano alle interazioni delle glicoproteine virali con i glicosaminoglicani della superficie cellulare durante le prime fasi di ingresso virale. L'eparina, che è nota per interferire con l'ingresso di molti virus, viene utilizzata come trattamento di controllo positivo in tale contesto. Per le nozioni di base sulle tecniche di virologia, la propagazione dei virus, la determinazione del titolo virale e l'espressione della dose infettiva nelle unità formanti placche (PFU), nelle unità di formazione del fuoco (FFU) o nella molteplicità dell'infezione (MOI), si rimanda il lettore al riferimento. Per esempi precedenti e condizioni ottimizzate utilizzate per i virus mostrati nei risultati rappresentativi, si rimanda il lettore ai riferimenti e ai dettagli elencati nella Tabella 1, Figura 1A.

1. Coltura cellulare, preparazione dei composti e citotossicità dei composti

1. Far crescere la rispettiva linea cellulare per il sistema di infezione virale da analizzare (Tabella 1). Per l'HCV, coltivare le cellule Huh-7.5 nel terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 U/ml di penicillina G, 200 μg/ml di streptomicina e 0,5 μg/ml di amfotericina B.
2. Preparare i composti in esame e i controlli utilizzando i rispettivi solventi: ad esempio, sciogliere CHLA e PUG in dimetilsolfossido (DMSO); preparare l'eparina in acqua sterile a doppia distillazione. Per tutte le diluizioni successive, utilizzare terreni di coltura.
   NOTA: La concentrazione finale di DMSO nei trattamenti con composti in esame è inferiore all'1% negli esperimenti; L'1% di DMSO è incluso come trattamento di controllo negativo nei test per il confronto.
3. Determinare la citotossicità dei composti in esame (ad esempio, CHLA e PUG) sulle cellule per l'infezione virale utilizzando un reagente che determina la vitalità cellulare come XTT (2,3-bis[2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-fenilammino)-carbonil]-2H-tetrazolio idrossido):
   1. Per l'HCV, seminare le cellule Huh-7.5 in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10⁴ cellule per pozzetto) e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ O/N per ottenere un monostrato.
   2. Applicare il controllo DMSO (1%) o l'aumento delle concentrazioni dei composti in esame CHLA e PUG (es. 0, 10, 50, 100 e 500 μM) ai pozzetti di coltura in triplicato.
   3. Incubare a 37 °C per 72 ore, quindi scartare il terreno nella piastra e lavare due volte le cellule con 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   4. Aggiungere 100 μl di soluzione di analisi dal kit di saggi di tossicologia in vitro a base di XTT a ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 °C per altre 3 ore per consentire la produzione di XTT formazan
   .
   5. Determinare l'assorbanza con un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di prova di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nm.
   6. Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare (%) = At / As × 100%, dove "At" e "As" si riferiscono rispettivamente all'assorbanza dei composti in esame e ai trattamenti di controllo con solvente (es. 1% di DMSO). Determinare la concentrazione del 50% di citotossicità cellulare (CC₅₀) dei composti in esame da un software analitico come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.

2. Lettura dell'infezione virale

NOTA: La lettura dell'infezione virale dipende dal sistema virale utilizzato e può coinvolgere metodi come i test della placca o la misurazione dei segnali del reporter da virus marcati con il reporter. Il metodo per rilevare l'infezione da HCV reporter basato sull'attività del reporter luciferasi è descritto di seguito.

1. Raccogliere i surnatanti dai pozzetti infetti e chiarificare a 17.000 x g in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 °C.
2. Miscelare 20 μl di surnatante del test con 50 μl di substrato di luciferasi dal kit del saggio della luciferasi Gaussia e misurare direttamente con un luminometro secondo le istruzioni del produttore.
3. Esprimere l'infettività dell'HCV come log₁₀ delle unità di luce relativa (RLU) per determinare l'inibizione virale (%) e calcolare la concentrazione efficace del 50% (EC₅₀) dei composti in esame contro l'infezione da HCV utilizzando gli algoritmi del software GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.

3. Saggio di attaccamento virale

NOTA: Esempi di periodo di incubazione e dose virale per vari virus sono elencati nella Figura 1A, 'Allegato'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testate anche aumentando il MOI/PFU.

1. Seminare le cellule Huh-7.5 in una piastra a 96 pozzetti (1 × 10⁴ cellule per pozzetto) e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ O/N per ottenere un monostrato.
2. Pre-raffreddare i monostrati di celle in piastre a 4 °C per 1 ora.
3. Co-trattare le cellule con inoculo di HCV (MOI = 0,01) e composti di prova o controlli (le concentrazioni finali sono: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; eparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) a 4 °C per 3 ore. Ad esempio, a un inoculo virale da 90 μl contenente 1 x 10² FFU, aggiungere 10 μl di una diluizione di lavoro CHLA da 500 μM; questo produce un trattamento CHLA a una concentrazione finale di 50 μM e un'infezione da HCV a MOI = 0,01 sul monostrato cellulare.
   NOTA: È importante eseguire l'esperimento a 4 °C poiché consente il legame del virus ma ne preclude l'ingresso che avviene in modo più efficiente a 37 °C. Eseguire l'aggiunta di virus e composti di prova su ghiaccio e la successiva incubazione in un frigorifero a 4 °C per garantire che la temperatura sia mantenuta a 4 °C.
4. Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente il monostrato di cellule con 200 μl di PBS ghiacciato due volte.
   NOTA: Eseguire i lavaggi delicatamente per evitare di sollevare le celle.
5. Applicare 100 μl di terreno basale su ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 72 ore.
6. Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività della luciferasi come descritto in '2. Lettura dell'infezione virale".

Tabella 1: Tipo di cellula ospite per l'infezione virale.È indicato il tipo di cellula utilizzata per ciascun sistema di infezione virale descritto nei risultati rappresentativi. Ulteriori dettagli sulle celle sono disponibili nel riferimento.

virus	Tipo di cella
HCMV	Hel
Assistenza sanitaria	Huh-7.5
DENV-2	Vero
Mv	CHO-SLAM
Rsv	HEp-2

Risultati

Figura 1. Valutazione delle attività antivirali dei composti in esame CHLA e PUG contro l'adesione e l'ingresso/fusione del virus.(A) La procedura sperimentale, la concentrazione del virus (PFU/pozzetto o MOI) e il tempo di aggiunta e trattamento con i composti in esame (i, ii, iii) sono presentati per ciascun virus negli schemi e nelle tabelle associate. Nell'analisi dell'attacco del virus (barre gr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	GIBCO	Codice 11995-040
FBS	GIBCO	Codice 26140-079
Penicillina-Streptomicina	GIBCO	Codice 15070-063
Amfotericina B	GIBCO	Codice 15290-018
Dmso	sigma	D5879
Kit di test per tossicologia in vitro, a base di XTT	sigma	TOX2
PBS pH 7,4	GIBCO	10010023
Lettore di micropiastre	Strumento Bio-Tek, Inc.	ELx800
Microcentrifuga	Termo Scientifico	75002420
Kit per il dosaggio della luciferasi BioLux Gaussia	Biolaboratori del New England	E3300L
Luminometro	Promega	GloMax-20/20