Nota: Assicurarsi che tutte le procedure che coinvolgono la coltura cellulare e l'infezione virale siano condotte in cappe di biosicurezza certificate che siano appropriate per il livello di biosicurezza dei campioni da manipolare. Ai fini della descrizione dei protocolli, l'HCV marcato con Gaussia luciferasi reporter viene utilizzato come virus modello. Nel contesto dei risultati rappresentativi, i composti acido chebulagico (CHLA) e punicalagina (PUG) sono utilizzati come antivirali candidati che mirano alle interazioni delle glicoproteine virali con i glicosaminoglicani della superficie cellulare durante le prime fasi di ingresso virale. L'eparina, che è nota per interferire con l'ingresso di molti virus, viene utilizzata come trattamento di controllo positivo in tale contesto.
1. Coltura cellulare, preparazione dei composti e citotossicità dei composti
- Far crescere la rispettiva linea cellulare per il sistema di infezione virale da analizzare (Tabella 1). Per l'HCV, coltivare le cellule Huh-7.5 nel terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 U/ml di penicillina G, 200 μg/ml di streptomicina e 0,5 μg/ml di amfotericina B.
- Preparare i composti in esame e i controlli utilizzando i rispettivi solventi: ad esempio, sciogliere CHLA e PUG in dimetilsolfossido (DMSO); preparare l'eparina in acqua sterile a doppia distillazione. Per tutte le diluizioni successive, utilizzare terreni di coltura.
Nota: La concentrazione finale di DMSO nei trattamenti con composti in esame è inferiore all'1% negli esperimenti; L'1% di DMSO è incluso come trattamento di controllo negativo nei test per il confronto.
- Determinare la citotossicità dei composti in esame (ad esempio, CHLA e PUG) sulle cellule per l'infezione virale utilizzando un reagente che determina la vitalità cellulare come XTT (2,3-bis[2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-fenilammino)-carbonil]-2H-tetrazolio idrossido):
- Per l'HCV, seminare le cellule Huh-7.5 in una piastra a 96 pozzetti (1 × 104 cellule per pozzetto) e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 O/N per ottenere un monostrato.
- Applicare il controllo DMSO (1%) o l'aumento delle concentrazioni dei composti in esame CHLA e PUG (es. 0, 10, 50, 100 e 500 μM) ai pozzetti di coltura in triplicato.
- Incubare a 37 °C per 72 ore, quindi scartare il terreno nella piastra e lavare due volte le cellule con 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 100 μl di soluzione di analisi dal kit di saggi di tossicologia in vitro a base di XTT a ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 °C per altre 3 ore per consentire la produzione di XTT formazan
.
- Determinare l'assorbanza con un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di prova di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nm.
- Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute utilizzando la seguente formula: vitalità cellulare (%) = At / As × 100%, dove "At" e "As" si riferiscono rispettivamente all'assorbanza dei composti in esame e ai trattamenti di controllo con solvente (es. 1% di DMSO). Determinare la concentrazione del 50% di citotossicità cellulare (CC50) dei composti in esame da un software analitico come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.
2. Lettura dell'infezione virale
Nota: La lettura dell'infezione virale dipende dal sistema virale utilizzato e può coinvolgere metodi come i test della placca o la misurazione dei segnali del reporter da virus marcati con il reporter. Il metodo per rilevare l'infezione da HCV reporter basato sull'attività del reporter luciferasi è descritto di seguito.
- Raccogliere i surnatanti dai pozzetti infetti e chiarificare a 17.000 x g in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 °C.
- Miscelare 20 μl di surnatante del test con 50 μl di substrato di luciferasi dal kit del saggio della luciferasi Gaussia e misurare direttamente con un luminometro secondo le istruzioni del produttore.
- Esprimere l'infettività dell'HCV come log10 delle unità di luce relativa (RLU) per determinare l'inibizione virale (%) e calcolare la concentrazione efficace del 50% (EC50) dei composti in esame contro l'infezione da HCV utilizzando gli algoritmi del software GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore.
3. Ingresso virale/Saggio di fusione
Nota: Esempi di periodi di incubazione e dosi virali per vari virus sono elencati nella Figura 1A 'Ingresso/Fusione'. Concentrazioni più elevate del virus possono essere testate anche aumentando il MOI/PFU.
- Seminare le cellule Huh-7.5 in una piastra a 96 pozzetti (1 × 104 cellule per pozzetto) e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 O/N per ottenere un monostrato.
- Pre-raffreddare i monostrati di celle in piastre a 4 °C per 1 ora.
- Infettare le cellule con HCV (molteplicità dell'infezione, MOI = 0,01) a 4 °C per 3 ore. Ad esempio, utilizzare un inoculo virale da 100 μl contenente 1 x 102 unità di formazione del fuoco (FFU).
nota: Eseguire l'aggiunta dell'inoculo virale su ghiaccio e la successiva incubazione in frigorifero a 4 °C per mantenere la temperatura a 4 °C, che consente il legame virale ma non l'ingresso.
- Rimuovere il surnatante e lavare delicatamente i monostrati cellulari con 200 μl di PBS ghiacciato due volte.
nota: Eseguire i lavaggi delicatamente per evitare di sollevare le cellule.
- Trattare i pozzetti con i composti in esame o i controlli (le concentrazioni finali sono: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; eparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) e incubare a 37 °C per 3 ore. Ad esempio, aggiungere 10 μl di una diluizione di lavoro CHLA da 500 μM a 90 μl di terreno, miscelare e trattare i pozzetti; questo produce il trattamento CHLA a una concentrazione finale di 50 μM.
nota: Il passaggio da 4 °C a 37 °C facilita ora l'evento di ingresso/fusione virale e quindi consente di valutare l'effetto dei composti in esame su questa particolare fase.
- Aspirare il surnatante contenente il farmaco e rimuovere i virus extracellulari non internalizzati lavando con 200 μl di tampone citrato (50 mM di citrato di sodio, 4 mM di cloruro di potassio, pH 3,0) o PBS. Applicare 100 μl di terreno basale prima di incubare a 37 °C per 72 ore.
- Analizzare l'infezione risultante analizzando il surnatante per l'attività della luciferasi come descritto in '2. Lettura dell'infezione virale".
