Rilevamento colorimetrico di un biomarcatore batterico mediante una cartina di tornasole modificata

Abstract

Fonte: Tram, K., et al. Rilevamento colorimetrico di batteri utilizzando la cartina di tornasole. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un metodo di rilevamento colorimetrico di E. coli, che coinvolge un biomarcatore di E. coli che attiva un DNAzima, portando alla scissione del legame RNA e al distacco di un coniugato DNAzima-ureasi. Un successivo test colorimetrico rileva il biomarcatore di E. coli attraverso le variazioni di pH indotte dall'ammoniaca.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule di E. coli per i test

1. Per la sospensione cellulare desiderata, trasferire 1 ml di stock coltivato in una provetta per microfuge da 1,5 ml.
2. Centrifugare le celle a 6.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
3. Aggiungere 10 μl di tampone di reazione al pellet cellulare e risospendere le cellule. Sonicare la sospensione cellulare per 5 minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una ghiacciaia per 5 minuti.
4. Sonicare la sospensione cellulare per altri 5 minuti.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Utilizzare il surnatante per il test (10 μl).

2. Prova del nove

1. In una provetta per microfuge da 1,5 ml, prelavare la provetta aggiungendo e agitando 100 μl di tampone di reazione (RB) nella provetta per microfughe e scartando il tampone.
2. Trasferire 15 μl di EC1 assemblato nella provetta per microfughe lavata.
3. Lavare le perle magnetiche posizionando il tubo di microfuga su una griglia magnetica. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Rimuovere la provetta per microfuge dal rack, aggiungere 100 μl di RB e risospendere con cautela le microsfere magnetiche.
4. Lavare l'MB altre due volte ripetendo il passaggio 2.3.
5. Riposizionare la provetta per microfugi sulla rastrelliera magnetica, rimuovere il surnatante e aggiungere il campione di E. coli da 10 μl preparato dal passaggio 1.3.
6. Mescolare accuratamente il campione e le perle magnetiche picchiettando delicatamente sul tubo per microfuge.
7. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 1 ora.
8. Alla reazione, aggiungere 90 μl di ddH₂O e posizionare la provetta per microfuga su un rack magnetico.
9. Dopo circa 3 minuti di separazione magnetica, trasferire con cautela 85 μl di surnatante in una provetta per microfusibile da 0,5 ml. Estrarre lentamente il surnatante per evitare di raccogliere perle magnetiche.
10. Alla provetta per microfusi di cui sopra aggiungere 15 μl di rosso fenolo allo 0,04% e 100 μl di soluzione di substrato.
11. Scatta una fotografia a intervalli di tempo specifici per registrare il cambiamento di colore.
    nota: La variazione del pH può essere monitorata anche utilizzando un pHmetro con un microelettrodo. Il pH iniziale dovrebbe essere di circa 5,2-5,5 (la soluzione è gialla). In caso contrario, la soluzione può essere regolata mediante l'aggiunta di 1 mM di tampone acetato pH 5.0).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	VWR AMRESCO	105
Pellet di idrossido di sodio (NaOH)	BIO BASIC CANADA INC	SB6789
Tris-base	VWR AMRESCO	497
urea	VWR AMRESCO	M123
Xilencianolo FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
0,04% Rosso fenolo	SIGMA-ALDRICH	P3532
10x tampone di reazione della polinucleotide chinasi T4	Lucigene	Codice 30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Perlina magnetica (BioMag)	Laboratori Bangs Inc
Rack di separazione magnetico	Biolaboratori del New England	S1506S
Tubi per microfuge	Sarstedt	72,69
Incubatore per colture cellulari	Eppendorf Scientific	M13520000
Branson Pulitore ad ultrasuoni	Branson	N/A