Un test reporter sulla luciferasi per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus

In questo articolo

Abstract

Fonte: Dhungel, P., et al. Saggio reporter della luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da Poxvirus. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un test per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus. Le cellule non infette e infettate da virus sono state co-trasfettate con mRNA codificanti per la luciferasi della lucciola (Fluc) e la Renilla luciferasi (Rluc), con l'mRNA di Fluc contenente una sequenza leader 5' Poly(A). Dopo l'aggiunta di substrati bioluminescenti su cellule lisate, misurare il segnale di entrambe le luciferasi per identificare il vantaggio traduzionale dell'mRNA di Fluc nelle cellule infettate da virus, conferito dalla sequenza leader.

Protocollo

1. Trasfetta l'mRNA nelle cellule

Seminare le cellule HeLa in una piastra a 24 pozzetti (che deve essere circa ~80-90% confluente il giorno successivo) e incubare per una notte in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.
Infettare le cellule HeLa con il virus vaccinico (VACV) a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 o conservare le cellule HeLa non infette per il confronto.
nota: MOI è il numero di particelle virali infettive per cellula.
MOI di X= {[(Numero di cellule * X) / Titolo del virus] * 1000} μl di virus per 1 mL di terreno.
Dopo l'h post-infezione (hpi) desiderata (in questo esperimento a 10-12 hpi), trasfettare l'mRNA (500 ng di mRNA totale per pozzetto di piastre a 24 pozzetti) utilizzando un reagente di trasfezione lipidica cationica come mostrato nella Figura 1C.
1. Per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, mescolare 480 ng di mRNA della luciferasi della luciferasi della lucciola, 12A-Fluc, e 20 ng, della sequenza Kozak contenente l'mRNA della luciferasi Renilla (Kozak-Rluc) in una provetta per microcentrifuga. In un'altra provetta da microcentrifuga aggiungere 1,1 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica.
2. Aggiungere 55 μl di terreno sierico ridotto in entrambe le provette. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
3. Dopo 5 minuti di incubazione, aggiungere 55 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica contenente terreno sierico ridotto in una provetta contenente mRNA contenente mRNA.
4. Mescolare delicatamente ma accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
5. Durante l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 400 μl di terreno di siero ridotto per pozzetto di piastre da 24 pozzetti.
6. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μl della miscela goccia a goccia e in modo uniforme in un pozzetto di piastre a 24 pozzetti.

2. Misura le attività della luciferasi

Cinque ore dopo la co-trasfezione dell'mRNA di 12A-Fluc e Kozak-Rluc, misurare l'attività della luciferasi utilizzando un sistema di dosaggio della luciferasi in grado di eseguire due saggi reporter (ad esempio, kit di test Dual-Luciferase Reporter).
Rimuovere il terreno sierico ridotto e lisare le cellule aggiungendo 150 μl di tampone di lisi 1x, un componente del kit del saggio della luciferasi.
Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, raccogliere il lisato raschiando le cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga.
Centrifugare il lisato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C fino a formare detriti di celle a pellet.
Aggiungere 30 μl di surnatante in una piastra di saggio bianca a 96 pozzetti con pareti opache e fondo solido.
Misurare la doppia luminescenza utilizzando il kit per il dosaggio della luciferasi e un luminometro con lettore di piastre multimodale.
Eseguire la misurazione utilizzando la funzione cinetica (per ogni pozzetto) utilizzando le impostazioni descritte nella Tabella 1.
nota: La lettura può essere effettuata anche utilizzando un luminometro manuale. Aggiungere un volume uguale di lisato e substrato per Fluc in una cuvetta. Attendi 2 s e misura per 10 s utilizzando un luminometro. Dopo la misurazione Fluc, estrarre rapidamente la cuvetta dal luminometro e aggiungere manualmente un volume uguale del substrato per Rluc. Ancora una volta, attendi 2 s e misura per 10 secondi usando un luminometro.
Esporta i dati di lettura della luminescenza in un formato di file desiderabile.
Determinare il tasso di traduzione relativo dall'mRNA 12A-Fluc nelle cellule HeLa non infette e infettate da VACV dividendo il valore Fluc per il valore Rluc del controllo interno.
NOTA: La Figura 2 mostra l'analisi passo dopo passo dei dati grezzi per ottenere l'attività relativa di Fluc.

Tabella 1: Impostazioni di misurazione della luciferasi - i passaggi per la misurazione della luciferasi con il volume o il tempo consigliato.

Passi	Volume/Tempo
Iniettare il substrato del saggio della luciferasi (Fluc):	30 μl
Tempo di attesa / Incubazione:	2 secondi
Misurazione della luminescenza (Fluc):	10 secondi
Substrato Stop & Glo (Rluc):	30 μl
Tempo di attesa / Incubazione:	2 secondi
Misurazione della luminescenza (Rluc):	10 secondi

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Risultati

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Figura 1: sintesi e trasfezione dell'mRNA. (A) Schema della trascrizione in vitro. Il DNA amplificato mediante PCR contiene il gene della luciferasi a valle del 5'-UTR di interesse e il promotore T7 viene utilizzato come stampo. La RNA polimerasi T7 viene reclutata nel promotore e aggiunge ribonucleotidi, mostrati in bianco, dalla direzione 5' alla 3'. Una volta che l'mRNA è...