Un test reporter sulla luciferasi per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus

In questo articolo

Abstract

Fonte: Dhungel, P., et al. Saggio reporter della luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da Poxvirus. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un test per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus. Le cellule non infette e infettate da virus sono state co-trasfettate con mRNA codificanti per la luciferasi della lucciola (Fluc) e la Renilla luciferasi (Rluc), con l'mRNA di Fluc contenente una sequenza leader 5' Poly(A). Dopo l'aggiunta di substrati bioluminescenti su cellule lisate, misurare il segnale di entrambe le luciferasi per identificare il vantaggio traduzionale dell'mRNA di Fluc nelle cellule infettate da virus, conferito dalla sequenza leader.

Protocollo

1. Trasfetta l'mRNA nelle cellule

Seminare le cellule HeLa in una piastra a 24 pozzetti (che deve essere circa ~80-90% confluente il giorno successivo) e incubare per una notte in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.
Infettare le cellule HeLa con il virus vaccinico (VACV) a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 o conservare le cellule HeLa non infette per il confronto.
nota: MOI è il numero di particelle virali infettive per cellula.
MOI di X= {[(Numero di cellule * X) / Titolo del virus] * 1000} μl di virus per 1 mL di terreno.
Dopo l'h post-infezione (hpi) desiderata ....

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Risultati

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Figura 1: sintesi e trasfezione dell'mRNA. (A) Schema della trascrizione in vitro. Il DNA amplificato mediante PCR contiene il gene della luciferasi a valle del 5'-UTR di interesse e il promotore T7 viene utilizzato come stampo. La RNA polimerasi T7 viene reclutata nel promotore e aggiunge ribonucleotidi, mostrati in bianco, dalla direzione 5' alla 3'. Una volta che l'mRNA è.......