Un metodo di micropiastra per valutare la concentrazione inibitoria minima di un antibiotico

Abstract

Fonte: Ketelboeter, L. M., et al. Metodi per inibire la produzione batterica di piomelanina e determinare il corrispondente aumento della sensibilità allo stress ossidativo. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra un metodo basato su piastra per microtitolazione per determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) degli antibiotici in prova contro i batteri. Dopo l'aggiunta di una sospensione del patogeno batterico Pseudomonas aeruginosa a una piastra per microtitolazione contenente diluizioni seriali di un antibiotico in esame e di un inibitore della produzione di piomelanina da parte dei batteri, viene misurata la densità ottica dei pozzetti per calcolare la concentrazione inibitoria minima dell'antibiotico e l'impatto dell'inibitore della produzione di piomelanina sulla sensibilità agli antibiotici dei batteri.

Protocollo

1. Saggio della concentrazione minima inibitoria (MIC) di antibiotici in piastre a 96 pozzetti

1. Impostare colture notturne dei ceppi da testare in LB (Luria-Bertani) con e senza NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione).
   nota: Questo protocollo è descritto utilizzando il livello rappresentativo di 300 μM NTBC.
   1. Aggiungere 300 μM di NTBC a 2 ml di LB. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (dimetilsolfossido, DMSO) a 2 ml di LB per la condizione di assenza di NTBC.
   2. Utilizzando stuzzicadenti sterili, inoculare le provette con una colonia isolata di batteri. Ci sarà una cultura con NTBC e una cultura senza NTBC per ogni ceppo. Incubare per una notte a 37 °C con aerazione utilizzando un rotatore per colture tissutali in un incubatore ad aria.
2. Il giorno seguente, realizzare le soluzioni master LB + NTBC e LB + DMSO per l'impostazione del test MIC. Aggiungere NTBC a una concentrazione di 600 μM poiché questo sarà diluito due volte quando viene aggiunto l'inoculo, ottenendo una concentrazione finale di 300 μM.
   1. Per testare un antibiotico per un ceppo, aggiungere 600 μM di NTBC a 2 ml di LB e mescolare per ottenere la soluzione master NTBC. Aggiungere un volume equivalente di veicolo (DMSO) a 2 ml di LB e mescolare per ottenere la soluzione master senza NTBC. Utilizzare queste soluzioni per la creazione di soluzioni madre antibiotiche e per l'impostazione della serie di diluizione in piastre a 96 pozzetti.
      nota: Le formulazioni della soluzione master produrranno soluzioni extra per tenere conto degli errori di pipettaggio. Le soluzioni master possono essere scalate verso l'alto o verso il basso a seconda del numero di antibiotici e ceppi testati.
3. Preparare le soluzioni antibiotiche nelle soluzioni master LB + NTBC o LB + DMSO.
   nota: La concentrazione di antibiotici in queste soluzioni dovrebbe essere il doppio della concentrazione finale desiderata. Dovrebbe essere preparata una soluzione sufficiente per trasferire 100 μl in quattro pozzetti in una piastra da 96 pozzetti.
   1. Preparare la soluzione madre di gentamicina +/- NTBC a 64 μg/ml. Per realizzare questa soluzione, aggiungere 0,288 μl di stock di gentamicina (100 mg/ml) a 450 μl di LB + NTBC o LB + soluzione master DMSO.
      NOTA: La concentrazione massima di gentamicina per Pseudomonas aeruginosa PAO1 è di 32 μg/ml.
   2. Preparare la soluzione madre di kanamicina +/- NTBC a 256 μg/ml. Per realizzare questa soluzione, aggiungere 3,84 μl di stock di kanamicina (30 mg/ml) a 450 μl di soluzioni master LB + NTBC o LB + DMSO.
      nota: La concentrazione massima di kanamicina per P. aeruginosa PAO1 è di 128 μg/ml.
   3. Preparare la soluzione madre di tobramicina +/- NTBC a 8 μg/ml. Per realizzare questa soluzione, aggiungere 0,36 μl di stock di tobramicina (10 mg/ml) a 450 μl di soluzioni master LB + NTBC o LB + DMSO.
      nota: Per P. aeruginosa PAO1, la concentrazione massima di tobramicina è di 4 μg/ml.
      nota: Gli antibiotici e le concentrazioni possono essere regolati per i batteri da testare.
4. Aggiungere 100 μl di ciascuna soluzione antibiotica 2x a quattro pozzetti in una piastra da 96 pozzetti. Posizionare queste soluzioni nella riga A. Ad esempio, la gentamicina deve essere collocata da A1 a A4, la kanamicina da A5 a A8 e la tobramicina da A9 a A12. Vedere la Figura 1A per un diagramma di una configurazione di piastre a 96 pozzetti.
   nota: È possibile testare più antibiotici in una piastra, ma è necessario testare un solo ceppo per piastra per eliminare il potenziale di contaminazione incrociata da altri ceppi.
5. Aggiungere 50 μl della soluzione master LB + NTBC o LB + DMSO alle file da B a H della piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che una piastra sia LB + NTBC e una piastra sia LB + DMSO. Vedere la Figura 1A.
   1. Usa LB + NTBC per gli antibiotici in LB + NTBC. Usa LB + DMSO per gli antibiotici in LB + DMSO.
6. Utilizzando un micropipettatore, eseguire due diluizioni seriali degli antibiotici trasferendo 50 μl della soluzione dalla fila A alla fila B. Mescolare la soluzione, sostituire i puntali delle pipette e trasferire 50 μl di soluzione dalla riga B alla riga C. Ripetere per le file rimanenti. Dopo aver diluito la fila G, rimuovere 50 μl della soluzione da tale fila e gettarla. Utilizzare la riga H come controllo non antibiotico per la crescita batterica. Vedere Figura 1B.
   NOTA: Ogni pozzetto nelle file da A a G contiene ora 50 μl di antibiotico in LB + NTBC o LB + DMSO a 2 volte la concentrazione finale desiderata. La riga H contiene LB + NTBC o LB + DMSO senza antibiotici.
7. Misurare l'OD₆₀₀ delle colture notturne. Lavare tutte le colture prima di eseguire le letture OD₆₀₀ per eliminare la piomelanina presente nei terreni.
   1. Lavare le colture centrifugando 1 ml di coltura in una microcentrifuga a 16.000 x g per 2 minuti. Rimuovere il surnatante con un micropipettatore e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di libbra.
8. Diluire le colture notturne a 2,75x10⁵ CFU/ml in LB.
   nota: Supponiamo che un'unità OD₆₀₀ sia l'equivalente di 1x10⁹ CFU/ml per P. aeruginosa. Le conversioni da OD a CFU/ml possono essere diverse in altri batteri.
9. Aggiungere 50 μl della coltura batterica diluita al pozzetto appropriato.
   nota: Le colture coltivate in NTBC devono essere aggiunte ai pozzetti contenenti NTBC e le colture coltivate in DMSO devono essere aggiunte ai pozzetti contenenti DMSO. Vedere la Figura 1B.
   1. Aggiungere i batteri a tre pozzetti per ogni ceppo e concentrazione di antibiotici. Aggiungere 50 μl di LB al quarto pozzetto per fungere da controllo della contaminazione batterica. Vedere la Figura 1B.
   2. Utilizzare un micropipettatore multicanale per inoculare i pozzetti. Assicurarsi che i puntali delle pipette siano vicino al fondo dei pozzetti quando si aggiunge l'inoculo per evitare la contaminazione dei pozzetti vicini.
      nota: L'aggiunta di coltura batterica ai pozzetti diluirà di due volte le concentrazioni di antibiotici e NTBC.
10. Coprire le piastre a 96 pozzetti con parafilm e incubare per circa 24 ore a 37 °C. Incubare staticamente le piastre a 96 pozzetti, in un incubatore ad aria.
11. Esaminare le piastre per verificare la presenza di batteri nei pozzetti. La MIC è la concentrazione più bassa di antibiotico in cui non si osserva alcuna crescita batterica per tutte e tre le repliche di ciascun ceppo.
    1. Esaminare visivamente la lastra per la crescita o leggerla utilizzando un lettore di piastre impostato su OD₆₀₀.

Risultati

Figura 1: Schema del test MIC per antibiotici Impostazione della piastra a 96 pozzetti. (A) 100 μl di antibiotici 2x della massima concentrazione iniziale si trovano nella riga A. Le file da B a H sono riempite con 50 μl di LB + NTBC o LB + DMSO senza antibiotici. (B) Le diluizioni seriali doppie vengono eseguite nelle file da A a G, ottenendo 50 μl ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-cicloesandione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50 mg	Chiamato anche nitisinone. Solubile in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % in peso in H2O. Stabilizzato.
Gentamicina	Oro Bio	G-400-100	Solubile in H2O. Filtro sterilizzare.
Kanamicina	Fisher Scientifico	BP906-5	Solubile in H2O. Filtro sterilizzare.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Solubile in H2O. Filtro sterilizzare.