1. Produzione di idrogel sottili di poliacrilammide (PA) a due strati su piastre multipozzetto
- Fabbricazione di idrogel di poliacrilammide
nota: Vedere la Figura 1.
- Preparare soluzioni acquose che contengano il 3-10% della soluzione stock di acrilammide al 40% (vedere la Tabella dei materiali) e lo 0,06-0,6% della soluzione stock di bis-acrilammide (vedere la Tabella dei materiali) per produrre idrogel con rigidità regolabile che varia da 0,6 kPa a 70 kPa. Vedere la tabella 1.
- Per gli idrogel da 0,6 kPa, miscelare il 3% di acrilammide con lo 0,045% di bis-acrilammide. Per gli idrogel da 3 kPa, mescolare il 5% di acrilammide con lo 0,074% di bis-acrilammide. Per idrogel da 10 kPa, mescolare il 10% di acrilammide con lo 0,075% di bis-acrilammide. Per idrogel da 20 kPa, miscelare l'8% di acrilammide con lo 0,195% di bis-acrilammide. Per idrogel da 70 kPa, miscelare il 10% di acrilammide con lo 0,45% di bis-acrilammide.
NOTA: Ulteriori dettagli su come ottenere la desiderabile rigidità dell'idrogel PA sono disponibili altrove.
- Preparare due soluzioni acquose per ogni rigidità dell'idrogel desiderabile. Preparare la soluzione 1 in modo che sia priva di microsfere e la soluzione 2 in modo che contenga lo 0,03% di microsfere fluorescenti di diametro 0,1 μm (vedere la tabella dei materiali).
- Degassare le soluzioni 1 e 2 sotto vuoto per 15 minuti per eliminare l'ossigeno che è noto per inibire la polimerizzazione delle soluzioni.
- Aggiungere lo 0,6% dei 10 g/mL della soluzione madre di APS e lo 0,43% di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione 1 per consentire l'inizio della polimerizzazione. Agisci in fretta.
- Aggiungere 3,6 μl di soluzione 1 al centro di ciascun pozzetto della capsula a 24 pozzetti.
- Coprire immediatamente i pozzetti con vetrini coprioggetti circolari non trattati da 12 mm e lasciare riposare la soluzione 1 per 20 minuti in modo che polimerizzi completamente.
- Picchiettare delicatamente l'ago di una siringa su una superficie per creare un piccolo gancio sulla punta per facilitare la rimozione dei vetrini. Sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando l'ago della siringa.
- Aggiungere lo 0,6% della soluzione stock APS da 10 g/mL e lo 0,43% di TEMED alla soluzione 2. Depositare 2,4 μl della miscela sopra il primo strato in ogni pozzetto della capsula a 24 pozzetti.
- Coprire la Soluzione 2 con vetrini circolari in vetro da 12 mm, premendo delicatamente verso il basso con un paio di pinze per garantire che lo spessore del secondo strato sia minimo. Lasciare polimerizzare la soluzione 2 per 20 minuti.
- Aggiungere 500 μl di 50 mM HEPES pH 7.5 a ciascuno dei pozzetti, quindi rimuovere i vetrini coprioggetti con l'ago della siringa e la pinza.
- Sterilizzazione, rivestimento di collagene ed equilibratura di idrogel di poliacrilammide
- Esporre gli idrogel ai raggi UV per 1 ora nella cappa di coltura tissutale per consentire la sterilizzazione.
- Preparare una miscela di 0,5% peso/volume di sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilammino)esanoato (Sulfo-SANPAH, vedere la Tabella dei materiali) in DMSO all'1% e 50 mM di HEPES pH = 7,5.
- Aggiungere 200 μl di questa soluzione alla superficie superiore degli idrogel. Agendo rapidamente, esponili ai raggi UV (302 nm) per 10 minuti per attivarli.
- Lavare gli idrogel due volte con 1 mL di 50 mM HEPES pH = 7,5. Ripetere se necessario per assicurarsi che l'eventuale reticolante in eccesso venga rimosso.
- Rivestire gli idrogel con 200 μL di 0,25 mg/mL di Collagene I per coda di ratto (vedi Tabella dei materiali) in 50 mM di HEPES. Incubare gli idrogel, con la soluzione di collagene sopra, per una notte a temperatura ambiente.
nota: Per prevenire la disidratazione/evaporazione, posizionare le piastre a pozzetti multipli in un contenitore secondario e aggiungere fazzoletti per la pulizia da laboratorio imbevuti d'acqua nella periferia interna del contenimento.
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza o confocale con un obiettivo 40X per misurare lo spessore degli idrogel. A tale scopo, individuare le posizioni z del piano inferiore (dove si trova la superficie di vetro) e superiore dell'idrogel (dove l'intensità delle perle fluorescenti è massima). Quindi sottrai le posizioni z per determinare l'altezza.
nota: Abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza invertita e un obiettivo 40X con apertura numerica 0,65 per misurare lo spessore degli idrogel. A questo punto è possibile eseguire anche misurazioni al microscopio a forza atomica (AFM) per confermare l'esatta rigidità degli idrogel (vedi Figura 2).
- Prima di seminare le cellule di interesse sugli idrogel, aggiungere 1 mL di terreno sugli idrogel e incubarli a 37 °C per 30 minuti a 1 ora per garantire l'equilibrio.
nota: Abbiamo aggiunto il terreno completo MCDB-131 perché è il terreno in cui sono state coltivate le cellule ospiti del modello (HMEC-1) (vedere il passaggio 2.1 per i dettagli).
2. Coltura di cellule endoteliali microvascolari umane e semina su idrogel
- Coltura di cellule HMEC-1 (endoteliali microvascolari umane) in terreni completi MCDB-131 contenenti terreni MCDB-131 integrati con il 10% di siero fetale bovino, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 1 μg/mL di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina (vedere la Tabella dei materiali).
- Dividere le colture confluenti 1:6 ogni 3 - 4 giorni e conservare le cellule fino al passaggio 40.
- Un giorno prima dell'esperimento, staccare le cellule dal loro recipiente di coltura utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25%. Per prima cosa, lavare le cellule e il loro recipiente di coltura 1 volta con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS), quindi aggiungere la quantità appropriata di tripsina/EDTA allo 0,25% (2 mL per piatto da 100 mm o pallone da 75 cm, 1 mL per piatto da 60 mm o pallone da 25 cm), incubando il pallone a 37 °C per 5-10 minuti per consentire il distacco delle cellule dal loro substrato.
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo il volume desiderato di terreno pieno MCDB-131, pipettare delicatamente per rompere i grumi di cellule, quindi posizionare la soluzione in una provetta da centrifuga conica.
- Agitare delicatamente la soluzione di cellule per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente, quindi estrarre 20 μl di soluzione e riempire molto delicatamente le due camere sotto il vetrino coprioggetti di un emocitometro di vetro.
- Pellettare la soluzione delle cellule contenute nella provetta conica da centrifuga mediante centrifugazione per 10 minuti a 500 x g.
- Durante il periodo di attesa di 10 minuti, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare un microscopio, mettere a fuoco le linee della griglia dell'emocitometro con un obiettivo 10X, quindi utilizzare un contatore di conteggio manuale per contare il numero di cellule in un quadrato di 1 mm x 1 mm.
- Spostare l'emocitometro su un altro quadrato di 1 mm x 1 mm, contare le cellule e ripetere il processo altre due volte. Calcola la media delle quattro misurazioni e poi moltiplica la media per 104. Il valore finale è il numero di cellule vitali/mL nella sospensione cellulare che viene centrifugata.
- Rimuovere il liquido dalla provetta da centrifuga conica assicurandosi che il pellet della cella non venga interrotto. Risospendere le cellule nel terreno pieno MCDB-131 a una concentrazione di 4 x 105 cellule/mL.
- Seminare le cellule in sospensione sugli idrogel rimuovendo prima il terreno con cui sono stati incubati gli idrogel e poi aggiungendo 1 mL di sospensione cellulare su ciascun idrogel.
3. Infezione di cellule endoteliali microvascolari umane con L. monocytogenes
- Tre giorni prima dell'infezione, strisciare il ceppo Lm da utilizzare da una scorta di glicerolo (conservato a -80 °C) su una piastra BHI-agar che contenga 7,5 μg/mL di cloramfenicolo e 200 μg/mL di streptomicina, se appropriato.
nota: Il ceppo da striare può essere un wild-type o mutante, che esprime costitutivamente la fluorescenza (per l'immunocolorazione è stato utilizzato JAT1045) o che esprime la fluorescenza sotto il promotore ActA (per la citometria a flusso o la microscopia della forza di trazione sono stati utilizzati JAT983 o JAT985).
- Incubare le piastre a 37 °C fino a formare colonie discrete (1 - 2 giorni).
- Il giorno prima dell'infezione, coltivare il ceppo desiderato durante la notte, agitandolo a 150 giri/min a 30 °C in terreno BHI con 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato).
- Posizionare 5 mL di terreno BHI in una provetta da centrifuga conica da 15 mL, aggiungere 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato) e quindi inoculare una singola colonia dalla piastra di agar utilizzando un puntale sterile da 10 μL.
- Il giorno successivo, appena prima dell'infezione, misurare la densità ottica della soluzione batterica a 600 nm (OD600) diluendo il campione 1:5; utilizzare una cuvetta contenente solo BHI come bianco.
- Diluire la coltura per una notte a un OD600 di 0,1 e incubarla, agitando per 2 ore a 30 °C, in terreno BHI con 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato) per consentire ai batteri di raggiungere la fase logaritmica.
- Misurare l'OD600 della soluzione batterica, che dovrebbe essere di circa 0,2 - 0,3. Se l'OD600 è superiore, diluirlo a 0,2 - 0,3 con il solo BHI.
- Assumere 1 mL di soluzione batterica in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 4 minuti a 2.000 x g utilizzando la centrifugazione a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di PBS per coltura tissutale, nella cappa di coltura tissutale. Lavare i batteri altre due volte facendoli girare per 4 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere i batteri in 1 mL di PBS.
- Preparare la miscela per l'infezione mescolando 10 o 50 μL di batteri risospesi in PBS con 1 mL di terreno completo MCDB-131 per una molteplicità di infezioni (MOI; cioè il numero di batteri per cellula ospite) di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite.
- Rimuovere il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti, facendo attenzione a non danneggiare gli idrogel o le cellule. Lavare le cellule 1 volta con 1 mL di terreno pieno MCDB-131 e quindi aggiungere 1 mL di batteri a ciascun pozzetto.
- Coprire il piatto con il suo coperchio e avvolgere i piatti con pellicola per alimenti in polietilene per evitare perdite. Posizionare le piastre nella centrifuga e centrifugare i campioni per 10 minuti a 200 x g per sincronizzare l'invasione. Spostare le piastre nell'incubatore per colture tissutali e incubarle per 30 minuti a 37 °C.
- Lavare i campioni 4 volte con il terreno pieno MCDB-131 e spostarli nell'incubatore per colture tissutali. Dopo altri 30 minuti, sostituire il terreno con un terreno integrato con 20 μg/mL di gentamicina.
4. Citometria a flusso per quantificare la suscettibilità dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare delle cellule ospiti alle infezioni
- Pesare 5 mg di collagenasi e metterla in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Aggiungere 10 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e mescolarli bene.
- 8 ore dopo l'infezione, rimuovere il terreno dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti e lavare i pozzetti 1 volta con PBS per coltura tissutale. Rimuovere il PBS dai pozzetti e aggiungere 200 μl della miscela tripsina-EDTA/collagenasi a ciascun pozzetto. Metterlo nell'incubatore di coltura tissutale per 10 minuti per consentire il completo distacco delle cellule.
- Utilizzare una pipetta nuova per ogni pozzetto e pipettare la miscela su e giù 8 volte. Essere delicati in modo da non danneggiare le cellule. Aggiungere 200 μl di terreno pieno in ciascun pozzetto per neutralizzare la tripsina.
- Trasferire la soluzione cellulare da 400 μl di ciascun pozzetto in una provetta di polistirene da 5 mL con un tappo filtrante da 35 μm (vedere la tabella dei materiali).
- Analizza 10.000 - 20.000 cellule per campione mediante citometria a flusso. Eseguire l'acquisizione dei dati tramite citometria a flusso e determinare la percentuale di cellule infette per pozzetto utilizzando il software disponibile in commercio. Utilizzare i grafici a dispersione diretta rispetto a quelli a dispersione laterale per controllare la maggior parte della distribuzione del conteggio delle celle.
NOTA:: Ciò garantirà l'analisi di singole cellule ed eliminerà detriti o doppiette o triplette cellulari.
- Misura il segnale di fluorescenza dalle cellule non infette da controllo e controlla la popolazione di cellule infette escludendo l'autofluorescenza.
Tabella 1. Composizione di idrogel di poliacrilammide (PA) di rigidità variabile. In questa tabella, la percentuale di soluzione madre di acrilammide al 40% e la percentuale di soluzione madre di bis-acrilammide al 2% per raggiungere una data rigidità (modulo di Young, E) sono indicate in diverse colonne.
| Modulo di Young (E, kPa) | % acrilammide (dal 40% di scorte) | Bisacrilammide % (da 2% di scorte) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
