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1. Produzione di idrogel sottili di poliacrilammide (PA) a due strati su piastre multipozzetto
- Sciogliere il persolfato di ammonio (APS) in acqua ultrapura distillata per ottenere una concentrazione finale di 10 g/mL. Aliquotare e conservare la soluzione a 4 °C per un uso a breve termine (3 settimane).
NOTA: La soluzione di cui sopra può essere preparata prima della fabbricazione dell'idrogel.
- Attivazione in vetro di piastre a 24 pozzetti
- Incubare piastre con fondo in vetro a 24 pozzetti con pozzetti di 13 mm di diametro (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora con 500 μL di idrossido di sodio (NaOH) 2 M per pozzetto a temperatura ambiente.
- Sciacquare i pozzetti 1 volta con acqua ultrapura e quindi aggiungere 500 μL di trietossisilano al 2% (3-amminopropil) (vedere la Tabella dei materiali) in etanolo al 95% in ciascun pozzetto per 5 minuti.
- Sciacquare nuovamente i pozzetti 1 volta con acqua e aggiungere 500 μl di glutaraldeide allo 0,5% in ciascun pozzetto per 30 minuti. Sciacquare i pozzetti 1 volta con acqua e asciugarli a 60 °C senza coperchio.
- Fabbricazione di idrogel di poliacrilammide
NOTA: Vedere la Figura 1.
- Preparare soluzioni acquose che contengano il 3-10% della soluzione stock di acrilammide al 40% (vedere la Tabella dei materiali) e lo 0,06-0,6% della soluzione stock di bis-acrilammide (vedere la Tabella dei materiali) per produrre idrogel con rigidità regolabile che varia da 0,6 kPa a 70 kPa. Vedere la tabella 1.
- Per gli idrogel da 0,6 kPa, miscelare il 3% di acrilammide con lo 0,045% di bis-acrilammide. Per gli idrogel da 3 kPa, mescolare il 5% di acrilammide con lo 0,074% di bis-acrilammide. Per idrogel da 10 kPa, mescolare il 10% di acrilammide con lo 0,075% di bis-acrilammide. Per idrogel da 20 kPa, miscelare l'8% di acrilammide con lo 0,195% di bis-acrilammide. Per idrogel da 70 kPa, miscelare il 10% di acrilammide con lo 0,45% di bis-acrilammide.
NOTA: Ulteriori dettagli su come ottenere la desiderabile rigidità dell'idrogel PA sono disponibili altrove.
- Preparare due soluzioni acquose per ogni rigidità dell'idrogel desiderabile. Preparare la soluzione 1 in modo che sia priva di microsfere e la soluzione 2 in modo che contenga lo 0,03% di microsfere fluorescenti di diametro 0,1 μm (vedere la tabella dei materiali).
- Degassare le soluzioni 1 e 2 sotto vuoto per 15 minuti per eliminare l'ossigeno che è noto per inibire la polimerizzazione delle soluzioni.
- Aggiungere lo 0,6% dei 10 g/mL della soluzione madre di APS e lo 0,43% di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione 1 per consentire l'inizio della polimerizzazione. Agisci in fretta.
- Aggiungere 3,6 μl di soluzione 1 al centro di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti (vedere il passaggio 1.2 per la sua preparazione).
- Coprire immediatamente i pozzetti con vetrini coprioggetti circolari non trattati da 12 mm e lasciare riposare la soluzione 1 per 20 minuti in modo che polimerizzi completamente.
- Picchiettare delicatamente l'ago di una siringa su una superficie per creare un piccolo gancio sulla punta per facilitare la rimozione dei vetrini. Sollevare i vetrini coprioggetti utilizzando l'ago della siringa.
- Aggiungere lo 0,6% della soluzione stock APS da 10 g/mL e lo 0,43% di TEMED alla soluzione 2. Depositare 2,4 μl della miscela sopra il primo strato in ogni pozzetto della capsula a 24 pozzetti.
- Coprire la Soluzione 2 con vetrini circolari in vetro da 12 mm, premendo delicatamente verso il basso con un paio di pinze per garantire che lo spessore del secondo strato sia minimo. Lasciare polimerizzare la soluzione 2 per 20 minuti.
- Aggiungere 500 μL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico 50 mM (HEPES) pH 7,5 a ciascuno dei pozzetti, quindi rimuovere i vetrini coprioggetti con l'ago della siringa e la pinza.
- Sterilizzazione, rivestimento di collagene ed equilibratura di idrogel di poliacrilammide
- Esporre gli idrogel ai raggi UV per 1 ora nella cappa di coltura tissutale per consentire la sterilizzazione.
- Preparare una miscela di 0,5% peso/volume di sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilammino)esanoato (Sulfo-SANPAH, vedere la Tabella dei materiali) in 1% di dimetilsolfossido (DMSO) e 50 mM di HEPES pH = 7,5.
- Aggiungere 200 μl di questa soluzione alla superficie superiore degli idrogel. Agendo rapidamente, esponili ai raggi UV (302 nm) per 10 minuti per attivarli.
- Lavare gli idrogel due volte con 1 mL di 50 mM HEPES pH = 7,5. Ripetere se necessario per assicurarsi che l'eventuale reticolante in eccesso venga rimosso.
- Rivestire gli idrogel con 200 μL di 0,25 mg/mL di Collagene I per coda di ratto (vedi Tabella dei materiali) in 50 mM di HEPES. Incubare gli idrogel, con la soluzione di collagene sopra, per una notte a temperatura ambiente.
NOTA: Per prevenire la disidratazione/evaporazione, posizionare le piastre multipozzetto in un contenitore secondario e aggiungere fazzoletti per la pulizia da laboratorio imbevuti di acqua nella periferia interna del contenimento.
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza o confocale con un obiettivo 40X per misurare lo spessore degli idrogel. A tale scopo, individuare le posizioni z del piano inferiore (dove si trova la superficie di vetro) e superiore dell'idrogel (dove l'intensità delle perle fluorescenti è massima). Quindi sottrai le posizioni z per determinare l'altezza.
NOTA: Abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza invertita e un obiettivo 40X con apertura numerica 0,65 per misurare lo spessore degli idrogel. A questo punto è possibile eseguire anche misurazioni al microscopio a forza atomica (AFM) per confermare l'esatta rigidità degli idrogel (vedi Figura 2).
- Prima di seminare le cellule di interesse sugli idrogel, aggiungere 1 mL di terreno sugli idrogel e incubarli a 37 °C per 30 minuti a 1 ora per garantire l'equilibrio.
NOTA: Abbiamo aggiunto il terreno completo MCDB-131 perché è il terreno in cui sono state coltivate le cellule ospiti del modello (HMEC-1) (vedere il passaggio 2.1 per i dettagli).
2. Coltura di cellule endoteliali microvascolari umane e semina su idrogel
- Coltura di cellule HMEC-1 (endoteliali microvascolari umane) in terreni completi MCDB-131 contenenti terreni MCDB-131 integrati con il 10% di siero fetale bovino, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico, 1 μg/mL di idrocortisone e 2 mM di L-glutammina (vedere la Tabella dei materiali).
- Dividere le colture confluenti 1:6 ogni 3-4 giorni e conservare le cellule fino al passaggio 40.
- Un giorno prima dell'esperimento, staccare le cellule dal loro recipiente di coltura utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25%. Per prima cosa, lavare le cellule e il loro recipiente di coltura 1 volta con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS), quindi aggiungere la quantità appropriata di tripsina/EDTA allo 0,25% (2 mL per piatto da 100 mm o pallone da 75 cm, 1 mL per piatto da 60 mm o pallone da 25 cm), incubando il pallone a 37 °C per 5 - 10 minuti per consentire il distacco delle cellule dal loro substrato.
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo il volume desiderato di terreno pieno MCDB-131, pipettare delicatamente per rompere i grumi di cellule, quindi posizionare la soluzione in una provetta da centrifuga conica.
- Agitare delicatamente la soluzione di cellule per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente, quindi estrarre 20 μl di soluzione e riempire molto delicatamente le due camere sotto il vetrino coprioggetti di un emocitometro di vetro.
- Pellettare la soluzione delle cellule contenute nella provetta conica da centrifuga mediante centrifugazione per 10 minuti a 500 x g.
- Durante il periodo di attesa di 10 minuti, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare un microscopio, mettere a fuoco le linee della griglia dell'emocitometro con un obiettivo 10X, quindi utilizzare un contatore di conteggio manuale per contare il numero di cellule in un quadrato di 1 mm x 1 mm.
- Spostare l'emocitometro su un altro quadrato di 1 mm x 1 mm, contare le cellule e ripetere il processo altre due volte. Calcola la media delle quattro misurazioni e poi moltiplica la media per 104. Il valore finale è il numero di cellule vitali/mL nella sospensione cellulare che viene centrifugata.
- Rimuovere il liquido dalla provetta da centrifuga conica assicurandosi che il pellet della cella non venga interrotto. Risospendere le cellule nel terreno pieno MCDB-131 a una concentrazione di 4 x 105 cellule/mL.
- Seminare le cellule in sospensione sugli idrogel rimuovendo prima il terreno con cui sono stati incubati gli idrogel e poi aggiungendo 1 mL di sospensione cellulare su ciascun idrogel.
3. Infezione di cellule endoteliali microvascolari umane con Listeria monocytogenes (Lm)
- Preparazione anticipata
NOTA: Preparare in anticipo le seguenti soluzioni.
- Stock di streptomicina, cloramfenicolo e gentamicina
- Preparare 50 mg/mL di soluzioni madre di streptomicina pesando 0,5 g di streptomicina solfato e sciogliendolo completamente in 10 mL di acqua ultrapura.
- Preparare 7,5 mg/mL di soluzioni madre di cloramfenicolo pesando 75 mg di cloramfenicolo e sciogliendolo completamente in 10 mL di etanolo al 100%.
- Preparare 20 mg/mL di soluzioni madre di gentamicina pesando 0,2 g di gentamicina solfato e sciogliendolo completamente in 10 mL di acqua ultrapura.
- Sterilizzare con filtro tutte le soluzioni madre con un filtro per siringa da 0,2 μm e conservarle a -20 °C per un uso a lungo termine (1 - 2 mesi).
- Terreni per infusione cardiaca cerebrale (BHI) e piastre di agar
- Individuare due palloni da 1 litro e aggiungere una barra di agitazione magnetica all'interno di ciascun pallone.
- Per i terreni BHI, aggiungere 37 g di polvere BHI in un pallone e aggiungere acqua ultrapura fino a 1 L. Mescolare energicamente la soluzione posizionando il pallone su una piastra di agitazione magnetica fino a quando la polvere non si è sciolta.
- Per le piastre di agar BHI, aggiungere 37 g di polvere BHI e 15 g di agar granulato (vedere la Tabella dei materiali) nel secondo pallone e aggiungere acqua ultrapura fino a 1 L. Mescolare energicamente la soluzione posizionando il pallone su una piastra di agitazione magnetica fino a quando la polvere non si è sciolta.
- Avvitare i coperchi dei palloni non troppo stretti e sterilizzare in autoclave le soluzioni utilizzando l'impostazione del liquido o secondo le specifiche dell'autoclave.
- Estrarre la soluzione dall'autoclave, quindi raffreddare la soluzione di agar-BHI a 55 °C. Se il materiale BHI nel pallone da 1 L viene mantenuto sterile, può essere utilizzato fino a un mese.
- Per preparare le piastre di agar-BHI batterico, aggiungere prima antibiotici, se appropriato, al pallone contenente BHI e agar (a seconda dei ceppi batterici da coltivare). Mettere brevemente il pallone su una piastra di agitazione magnetica per consentire una rapida miscelazione.
NOTA: Gli antibiotici utilizzati qui sono specifici per i ceppi Lm utilizzati, ma tutti gli antibiotici necessari possono essere utilizzati nelle piastre BHI-agar. Abbiamo aggiunto la streptomicina a una concentrazione di 200 μg/mL e il cloramfenicolo a una concentrazione di 7,5 μg/mL perché i ceppi 10403S Lm sono resistenti alla streptomicina. Questi ceppi sono stati coniugati con un plasmide che contiene il telaio di lettura aperto della cloramfenicolo acetiltransferasi, da cui la resistenza al cloramfenicolo.
- Versare il composto in piastre di coltura batterica in polistirene da 10 cm (circa 20 ml per piastra). Per eliminare le bolle, fiammeggiare brevemente la superficie superiore delle piastre. Raffreddare le piastre per una notte a temperatura ambiente.
- Il giorno successivo, sigillare le piastre asciutte e conservarle a 4 °C.
- Infezione delle cellule endoteliali microvascolari umane con L. monocytogenes
- Tre giorni prima dell'infezione, strisciare il ceppo Lm da utilizzare da una scorta di glicerolo (conservato a -80 °C) su una piastra BHI-agar che contenga 7,5 μg/mL di cloramfenicolo e 200 μg/mL di streptomicina, se appropriato.
NOTA: Il ceppo da striare può essere un wild-type o mutante, che esprime la fluorescenza costitutivamente (per l'immunocolorazione JAT1045 è stato utilizzato) o che esprime la fluorescenza sotto il promotore ActA (per la citometria a flusso o la microscopia della forza di trazione sono stati utilizzati JAT983 o JAT985).
- Incubare le piastre a 37 °C fino a formare colonie discrete (1 - 2 giorni).
- Il giorno prima dell'infezione, coltivare il ceppo desiderato durante la notte, agitandolo a 150 giri/min a 30 °C in terreno BHI con 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato).
- Posizionare 5 mL di terreno BHI in una provetta da centrifuga conica da 15 mL, aggiungere 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato) e quindi inoculare una singola colonia dalla piastra di agar utilizzando un puntale sterile da 10 μL.
- Il giorno successivo, appena prima dell'infezione, misurare la densità ottica della soluzione batterica a 600 nm (OD600) diluendo il campione 1:5; utilizzare una cuvetta contenente solo BHI come bianco.
- Diluire la coltura per una notte a un OD600 di 0,1 e incubarla, agitando per 2 ore a 30 °C, in terreno BHI con 7,5 μg/mL di cloramfenicolo (se appropriato) per consentire ai batteri di raggiungere la fase logaritmica.
- Misurare l'OD600 della soluzione batterica, che dovrebbe essere di circa 0,2-0,3. Se l'OD600 è superiore, diluirlo a 0,2 - 0,3 con il solo BHI.
- Assumere 1 mL di soluzione batterica in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 4 minuti a 2.000 x g utilizzando la centrifugazione a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di PBS per coltura tissutale, nella cappa di coltura tissutale. Lavare i batteri altre due volte facendoli girare per 4 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere i batteri in 1 mL di PBS.
- Preparare la miscela per l'infezione mescolando 10 o 50 μL di batteri risospesi in PBS con 1 mL di terreno completo MCDB-131 per una molteplicità di infezioni (MOI; cioè il numero di batteri per cellula ospite) di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite.
- Rimuovere il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti, facendo attenzione a non danneggiare gli idrogel o le cellule. Lavare le cellule 1 volta con 1 mL di terreno pieno MCDB-131 e quindi aggiungere 1 mL di batteri a ciascun pozzetto.
- Conservare un po' di miscela di infezione (almeno 100 μL) per la determinazione del MOI (vedere il passaggio 3.3).
- Coprire il piatto con il suo coperchio e avvolgere i piatti con pellicola per alimenti in polietilene per evitare perdite. Posizionare le piastre nella centrifuga e centrifugare i campioni per 10 minuti a 200 x g per sincronizzare l'invasione. Spostare le piastre nell'incubatore per colture tissutali e incubarle per 30 minuti a 37 °C.
- Lavare i campioni 4 volte con il terreno pieno MCDB-131 e spostarli nell'incubatore per colture tissutali. Dopo altri 30 minuti, sostituire il terreno con un terreno integrato con 20 μg/mL di gentamicina.
- Determinazione della molteplicità dell'infezione (MOI)
- Durante l'incubazione iniziale di 30 minuti delle cellule ospiti con i batteri, preparare diluizioni seriali di 10 volte della miscela di infezione per determinare il MOI. Effettuare diluizioni di 10 volte mescolando 100 μl della miscela di infezione con 900 μl di 1x PBS (diluizione 10-1). Quindi, mescolare 100 μl della diluizione 10-1 con 900 μl di PBS (diluizione 10-2).
- Continuare fino ad ottenere una diluizione di 10-5.
NOTA: Tutte le soluzioni devono essere miscelate bene prima di diluirle e ad ogni passaggio devono essere utilizzati puntali per pipette freschi e puliti.
- Una volta effettuate le diluizioni, posizionare 100 μl delle diluizioni 10-2 - 10-5 al centro delle piastre BHI/agar/cloramfenicolo/streptomicina (se appropriato).
- Crea uno spalmatore da una pipetta di vetro usando il fuoco per piegare la pipetta per creare un gancio. Immergere la pipetta in etanolo al 100% per la sterilizzazione e poi bruciare l'etanolo con una fiamma.
- Una volta raffreddato lo spandiconcime, stendere le diluizioni batteriche in modo omogeneo sulle piastre partendo dalla diluizione 10-5 e passando alle miscele più concentrate. Incubare le piastre capovolte a 37 °C per 2 giorni.
- A seconda della densità della colonia, determinare il numero di colonie delle piastre di diluizione 10-3 e 10-4 o 10-4 e 10-5. Calcola il MOI come segue:
numero di colonie × fattore di diluizione ÷ volume iniziale aggiunto = numero di unità formanti colonie (CFU) per μL
numero di CFU per μL × volume di miscela batterica per pozzetto = numero di CFU per pozzetto
numero di CFU per pozzetto × volume di cellule per pozzetto = numero di batteri per cellula
NOTA: CFU è l'acronimo di unità formanti colonie.
- Fare la media dei MOI da due piastre per ottenere i MOI finali.
4. Microscopia quantitativa time-lapse per valutare la rigidità della matrice extracellulare
Prepara gli idrogel PA su una piastra a 24 pozzetti (vedi passaggio 1), semina cellule HMEC-1 (vedi passaggio 2) e coltiva colture JAT983 durante la notte come descritto sopra (vedi passaggio 3).
- Il giorno dell'infezione, preparare la miscela per l'infezione mescolando 10 μL di pellet batterico per mL di terreno completo MCDB-131. Rimuovere con cautela il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti e aggiungere 1,9 mL di terreno completo MCDB-131 e 0,1 mL di miscela batterica a ciascun pozzetto.
NOTA: Il MOI inferiore utilizzato in questo test è necessario per analizzare gli eventi di disseminazione che partono da un singolo batterio che invade una cellula ospite.
- Coprite il piatto con il suo coperchio e sigillatelo con un involucro di plastica per evitare perdite. Posizionare le piastre nella centrifuga e centrifugare i campioni per 10 minuti a 200 x g per sincronizzare l'invasione.
- Spostare le piastre nell'incubatore di coltura tissutale e incubarle per 5 minuti.
- Lavare i campioni 4 volte con il terreno e spostarli nell'incubatore per colture tissutali. Dopo altri 5-7 minuti, sostituire il terreno con un terreno integrato con 20 μg/mL di gentamicina.
- Incubare la piastra nell'incubatore per altre 5 ore per consentire al promotore actA di accendersi e guidare l'espressione del frame di lettura aperto mTagRFP.
- Preparare un terreno di microscopia dal vivo integrando L-15 di Leibovitz con il 10% di siero fetale bovino, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico e 1 μg/mL di idrocortisone.
NOTA: L-15 contiene già 2 mM di L-glutammina, quindi non è necessario aggiungerne altri come nel caso dei terreni MCDB-131.
- Mescolare 1 μL di colorante Hoechst da 1 mg/mL con 1 mL di terreno pieno L-15 e aggiungerlo a ciascun pozzetto per colorare i nuclei delle cellule. Posizionare le cellule nell'incubatore per colture tissutali per 10 minuti e poi sostituire in ogni pozzetto il terreno pieno L-15 con 1 mL di terreno completo L-15 integrato con 20 μg/mL di gentamicina. Coprire la piastra con il suo coperchio e posizionarla in una camera ambientale del microscopio (vedi Tabella dei materiali) bilanciata a 37 °C.
NOTA: Per l'imaging, è stato utilizzato un microscopio a epifluorescenza invertita con una telecamera CCD (vedi Tabella dei materiali) e un obiettivo d'aria in fluorite 20X con 0,75 NA. La potenza è stata impostata al 50% e il tempo di esposizione a 50 ms. I filtri del microscopio utilizzati per mCherry sono rispettivamente 470/525 nm per l'eccitazione e l'emissione.
- Immagini di più posizioni ogni 5 minuti utilizzando una funzione di messa a fuoco automatica per monitorare la diffusione di Lm attraverso i monostrati HMEC-1 seminati su idrogel a rigidità variabile.
NOTA: L-15 è tamponato con HEPES, quindi non è necessario utilizzare CO2 durante l'imaging.
Tabella 1. Composizione di idrogel di poliacrilammide (PA) di rigidità variabile. In questa tabella, la percentuale di soluzione madre di acrilammide al 40% e la percentuale di soluzione madre di bis-acrilammide al 2% per raggiungere una data rigidità (modulo di Young, E) sono indicate in diverse colonne.
| Modulo di Young (E, kPa) | % acrilammide (dal 40% di scorte) | Bisacrilammide % (da 2% di scorte) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
