Determinazione dell'efficacia antivirale di farmaci sperimentali attraverso un test a placca

Abstract

Fonte: Yadavalli, T., et al. Espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali del virus dell'herpes simplex-1. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra il metodo per eseguire un test della placca utilizzando un virus ottenuto da cornea suina infetta. La cornea suina viene utilizzata per testare l'efficacia antivirale di farmaci sperimentali.

Protocollo

1. Quantificazione dell'infezione virale

NOTA: I titoli virali delle cornee suine dovrebbero essere valutati ogni giorno per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico.

1. Per quantificare il virus, seminare le cellule Vero a una densità di 5 x 10⁵ cellule per pozzetto se si utilizza una piastra a 6 pozzetti, come fatto in questo esperimento. Fallo un giorno prima dell'infezione. Incubare le cellule piastrate durante la notte per assicurarsi che siano confluenti per la quantificazione del virus.
2. Aliquotare 500 μL di terreno privo di siero in più provette per microcentrifuga. Inserire un tampone sterile con punta di cotone imbevuto nelle provette riempite di terreno prive di siero. I tamponi di cotone devono essere immersi e bagnati per almeno 5 minuti prima dell'uso.
3. Senza disturbare il terreno sottostante, trasportare la piastra corneale suina infetta in una cabina di biosicurezza. Utilizzando i tamponi di cotone bagnati, fare 3 giri in senso orario e 3 giri in senso antiorario ad un diametro di 5 mm dal centro della cornea suina infetta senza applicare una pressione eccessiva.
4. Reinserire il batuffolo di cotone nella provetta da microcentrifuga riempita di terreno privo di siero e ruotarlo in senso orario e antiorario 5 volte. La punta metallica del batuffolo di cotone deve essere tagliata corta in modo che si inserisca completamente in una provetta da microcentrifuga e il coperchio possa essere chiuso.
5. Posizionare la provetta da microcentrifuga contenente la punta di cotone tamponata su una macchina a vortice e agitare ad alta velocità per 1 minuto.
6. Eseguire la quantificazione del virus tramite un test della placca su questi campioni.
   nota: Questa fase di quantificazione deve essere eseguita nei giorni 2, 4 e, facoltativamente, 6 giorni dopo l'infezione.

2. Quantificazione del virus mediante saggio della placca

NOTA: Per eseguire un test di placca, coltiva e piatra le cellule Vero in una piastra a 6 pozzetti e assicurati una confluenza del 90% delle cellule prima dell'inizio del test. Utilizzare un pallone confluente da 75 cm² di queste cellule. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti all'interno di una cappa di biosicurezza.

1. Lavare il monostrato confluente di cellule Vero nel pallone con 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) fresca dopo aver aspirato il terreno di coltura. Ripetere nuovamente la fase di lavaggio con PBS dopo aver aspirato la prima serie di soluzioni di lavaggio.
2. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% al monostrato cellulare. Incubare il matraccio a 37 °C per 5 minuti. Ad occhio nudo, assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie interna del pallone. In caso contrario, attendere altri 5 minuti prima di esaminare nuovamente il pallone. Quando le cellule sembrano essere staccate, aggiungere 9 mL di terreno intero al monostrato per assicurarsi che le cellule si stacchino completamente dalla superficie del pallone.
3. Raccogliere tutte le cellule dal pallone insieme all'intero terreno e metterle in una provetta da centrifuga da 15 mL.
4. Per ogni pozzetto delle piastre a 6 pozzetti utilizzate per il saggio della placca, utilizzare 300 μl dalla provetta da centrifuga. Rabboccare ogni pozzetto della piastra a 6 pozzetti con 2 mL di terreno intero. Lasciare le piastre nell'incubatrice per una notte per consentire loro di crescere e formare un monostrato confluente in ogni pozzetto.
5. Per eseguire un test della placca, è necessario eseguire una diluizione seriale dei campioni prima della quantificazione del virus.
6. Eseguire una diluizione log101 volte del virus in provette per microcentrifuga utilizzando terreni privi di siero fino a raggiungere una diluizione di ^10-8. Quando a una diluizione di ^10-3, trasferire 1 mL di diluizione al monostrato di cellule piastrate dopo aver aspirato il terreno di crescita sulle cellule dalla piastra a 6 pozzetti, questa sarà la fase di infezione. Incubare la piastra infetta a 37 °C in incubatore per 2 ore.
7. Aspirare il terreno di coltura esistente, lavare delicatamente con PBS due volte per rivestire le cellule e aggiungere 2 ml di terreno carico di metilcellulosa per pozzetto a tutti e 6 i pozzetti. Incubare per 72 ore o fino a quando non si vede la formazione di placche. Le placche possono essere identificate dalla formazione di piccoli spazi tra le cellule nel monostrato cellulare.
8. Aggiungere lentamente 1 ml di metanolo nell'angolo di ciascun pozzetto, usando la parete come punta guida. Incubare la piastra a 6 pozzetti a temperatura ambiente per 15 minuti. Aspirare lentamente il contenuto di ciascun pozzetto dalla piastra senza disturbare o agitare il monostrato cellulare.
9. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro in cristallovioletto a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti, assicurandosi che tutte le cellule siano coperte. Incubare la piastra a 6 pozzetti al buio per 30 minuti. Scartare la soluzione di cristallovioletto aspirandola e asciugare i pozzetti su un foglio di carta assorbente.
10. Contare il numero di placche al pozzetto di diluizione più alto per quantificare il contenuto totale di virus nella soluzione di partenza. Ripetere il processo due volte per confermare il titolo virale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
30 g di aghi ipodermici.	Bd	305128
Flacone in vetro da 500 mL.	Thomas Scientific	844027
Cabina di biosicurezza con certificazione di biosicurezza di livello 2 (BSL-2).	Thermofisher Scientifico	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" tamponi standard sterili in alginato di calcio.	puritano	22029501
Raschietto per celle - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
provetta da centrifuga
Cristallo viola	Sigma Aldrich	Codice: C6158	Conservare la polvere in un luogo buio
Medium Eagle's modificato di Dulbecco - DMEM	GIBCO	41966029	Conservare a 4 °C fino all'uso
etanolo	Sigma Aldrich	E7023
Siero fetale bovino -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquotare in provette da 50 mL e conservare congelate fino al momento dell'uso
Celle Vero	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	Codice CRL-1586
Macchina a vortice
metanolo
Metilcellulosa
Provetta per microcentrifuga
Cornee suine	Park Packaging Co., Chicago, IL		Ordine speciale su richiesta
Coperture per banchi procedurali - secondo necessità.	Thermofisher Scientifico	S42400
Pipette sierologiche	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Attrezzature per il pipettaggio sierologico.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
stereoscopio	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Palloni per coltura tissutale, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Incubatori per colture tissutali in grado di mantenere una temperatura di CO2 del 5% e di 37 °C	Thermofisher Scientifico	Forma 50145523
Piastre trattate con coltura tissutale (6 pozzetti).	Thomas Scientific	T1006
tripsina