Un test per determinare l'inizio del biofilm polimicrobico su cellule infettate da virus

Abstract

Fonte: Plotkin, B. J. et al., Determinazione dell'inizio del biofilm su cellule infettate da virus da parte di batteri e funghi. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video illustra l'inizio della formazione di biofilm polimicrobici su cellule infettate da virus da parte di batteri e funghi. L'infezione da virus dell'herpes simplex impedisce l'adesione batterica alle cellule, impedendo la co-localizzazione batterico-fungina. Al contrario, le cellule non infette mostrano una co-localizzazione batterico-fungina e l'inizio della formazione di biofilm.

Protocollo

1. Ceppi HSV e Manipolazione

NOTA: Per il test vengono utilizzati HSV-1(KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ^- ricombinanti non diffusivi.

1. Utilizzare il virus di un singolo lotto e conservare a -80 °C in un rapporto 1:1 del terreno di coltura Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) con il 20% di siero fetale bovino (FBS) e latte scremato fino all'uso. Prima della conservazione del lotto virale, determinare la concentrazione del virus mediante il test di o-nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal).
2. Determinare la vitalità del virus e la molteplicità dell'infezione (MOI) mediante colorazione X-Gal per ogni test sperimentale eseguito utilizzando il test di ingresso del virus reporter, come descritto in precedenza (Figura 1).
3. Diluire il virus (Opt-MEM) al MOI desiderato. Fissare i monostrati (paraformaldeide; 0,5 ml/pozzetto) prima della colorazione. Posizionare i controlli di vitalità del virus in una piastra per microtitolazione separata in parallelo con le piastre per saggi polimicrobici.

2. HeLa 299 Gestione delle Celle

1. Coltivare a 37 °C, 5% CO₂ in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), gentamicina (50 μg/ml) e L-glutammina. Cellule di passaggio alla confluenza all'80% con la soluzione di tripsina (acido etilendiamminotetraacetico, 0,53 M EDTA; 0,05% tripsina; 5 ml/pallone).

3. C. albicans Manipolazione

NOTA: C. albicans ottenuto da una fonte di laboratorio clinico viene conservato a -80 °C nel latte scremato Remmel 2x medium.

1. Coltivare il brodo congelato su destrosio Sabouraud Medium (37 °C). Dopo 24 ore sottocoltivare il C. albicans su terreno di coltura (37 °C; 48 ore) per l'uso.
2. Generare forme di tubi germinali (GT) (prelevare colonie rappresentative; 3 ml di FBS; 3 ore; 37 °C; assorbanza₆₀₀ (Abs₆₀₀), 0,3). Dopo l'incubazione, lavare GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x; 4.000 x g). Aggiungere GT lavato all'HBSS riscaldato (37 °C; 0,32 Abs₆₀₀). Le forme GT dovrebbero essere il 99% delle cellule osservate, come determinato dalla conta emocitometrica.
3. Preparare sospensioni stock in forma di lievito (YF) scegliendo colonie di funghi rappresentative (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs₆₀₀). Contare il numero di forme YF/ml al microscopio utilizzando un emocitometro. Le forme YF dovrebbero essere il 99% delle cellule osservate come determinato dalla conta emocitometrica.
4. Produzione di massa fungina di lavoro (250 μl di stock GT o YF in 25 ml di HBSS; 37 °C; 10⁵ unità formanti colonie, (CFU/ml)

4. Manipolazione di S. aureus

1. Negozio Collezione di colture di tipo americano S. aureus, ATCC 25923 (-80 °C; Latte scremato Remmel 2x). Coltura su agar sangue di pecora (5%; 37 °C; 24 ore). Raccogliere le colonie rappresentative e trasferirle in un terreno di sali di mannitolo entro 2 giorni per lo stoccaggio (37 °C; 18 ore).
2. Marca S. aureus sospensione madre (3 ml HBSS; 1,32 Abs_{600 ;}10⁸ CFU/ml)
   1. Produrre un impasto di S. aureus funzionante (100 μl di materiale in 25 ml di HBSS; 10⁵ CFU/ml).

5. Sospensioni di Candida e S. aureus

1. Preparare una sospensione mista di C. albicans e S. aureus (250 μl di stock YF o GT e 100 μl di stock di S. aureus in 25 ml di HBSS).

6. Saggio del biofilm polimicrobico

1. Seminare piastre a 96 pozzetti con 200 μl di 2 x 10⁵ cellule HeLa/ml (livello di confluenza dell'85%). Piastre di roccia (30 - 45 min; 37 °C) prima dell'incubazione (37 °C; incubatore al 5% di CO₂; 18 ore). Monostrati di lavaggio (1x; Opt-MEM) quindi seminare con HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 gJ^- in 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 e 10). Incubare le piastre (3 ore; 37 °C; 5% CO₂). Utilizzare un solo ceppo virale al giorno.
2. Lavare i monostrati infetti (1x; soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Mg⁺² e Ca⁺²; 100 μl). Sostituire il PBS con l'HBSS caldo, lasciando 25 μl in ogni pozzetto.
   1. Aggiungere le sospensioni di lavoro YF, GT e/o S. aureus (100 μl; rapporto bersaglio/cellula =5:1; n=16) come indicato nella Tabella 1. Incubare le piastre (statico; 30 min; 37 °C; 5% CO₂).
3. Dopo l'incubazione, aspirare una colonna alla volta riempiendo immediatamente con 300 μl di PBS con Mg⁺² e Ca⁺². Ripetere questo passaggio due volte, quindi aggiungere il tampone di lisi per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA; filtro sterilizzato; 200 μl di diluizione 1:50).
4. Triturare rapidamente il lisato di cellule HeLa, quindi posizionare 50 μl sui sali di mannitolo (MS) e/o sui terreni di Fungisel (F) (Figura 2). Stendere il lisato utilizzando una bacchetta di vetro piegata a 90°. Incubare le piastre (18 ore a 37 °C). Conta manualmente il numero di colonie per piastra. I controlli consistono nell'adesione di S. aureus e/o C. albicans alle cellule HeLa non infette da HSV.

Tabella 1. Determinazione generale del modello dell'aderenza microbica nelle interazioni polimicrobiche.GT= Fenotipo del tubo germinale di Candida albicans; YF= Fenotipo della forma del lievito C. albicans; MSSA= Staphylococcus aureus meticillino-sensibile; MS= sali di mannitolo medio; F= Fungisel medium.

Risultati

Figura 1. Immagini di colorazione X-gal dell'infezione da HSV-1 dipendente dal dosaggio nelle cellule HeLa. Cellule HeLa infettate con HSV-1 a vari MOI e X-Gal colorati. (A) cellule HeLa in pozzetti di piastra a 96 pozzetti con controllo delle cellule HeLa finte e infette colorate con X-Gal; ingrandimento iniziale 20x; (B) cellule HeLa in pozzetti di piastra a 96 poz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C.albicans
BBL Sabouraud Destrosio	Bd	211584
Fungisel Agar	Punto scientifico	7205A
S.aureus
Mannitolo Sale Agar	Troy Biologicals	7143B
Agar di sangue di pecora	Troy Biologicals	221239
Cellule Hela
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, con 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina, senza piruvato di sodio	Corning	10-017-CM
Gentamicina 50mg/ml	sigma	Anno 1397	Concentrazione finale di 50 μg/ml nel DMEM completo
Tripsina EDTA (0,05% tripsina, 0,53M EDTA)Soluzione 1X	Corning	25-052-CI
Siero fetale bovino	Atlanta Biologicals	S11150	10% di concentrazione finale nel DMEM completo
Altri mezzi e reagenti
ONPG	Termo Scientifico	Codice: 34055
Ultra puro X gal	Invitrogen	Codice 15520-018
1x HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Punto scientifico	30042-500
Lisi RIPA	Tecnologie per la vita	Codice 89901
forniture
Piastre a 96 pozzetti	Sempreverde scientifico	222-8030-01F
Provette per coltura 100x13	Thomas Scientific	Codice 9187L61