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1. Soluzioni e Media
- Preparare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), brodo di destrosio Sabouraud e agar destrosio Sabouraud come da Tabella 1.
2. Condizioni di crescita dell'inoculo fungino
- Conservare tutti i ceppi fungini come ceppi congelati in glicerolo al 35% a -80 °C, fino al momento del bisogno.
- Esegui i passaggi seguenti prima di ogni esperimento.
- Per i ceppi di Candida albicans:
- Scongelare un flaconcino di riserva e trasferire da 200 μl a 10 mL di brodo di destrosio Sabouraud in una provetta sterile da 50 mL di polipropilene con tappo e coltura per una notte a 30 °C con agitazione (200 giri/min). Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il tappo leggermente aperto per una migliore aerazione della coltura.
- Per i ceppi di Cryptococcus neoformans:
- Raschiare la superficie congelata di una fiala di brodo. Placcare le cellule su piastre di agar destrosio Sabouraud e incubare per 48 ore a 30 °C. Dopo la crescita visibile delle colonie isolate, conservare le piastre in frigorifero (4 °C) sigillate con pellicola di paraffina per un massimo di 15 giorni.
- Prelevare una colonia isolata di medie dimensioni dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile o un'ansa di inoculazione sterile e inoculare 10 ml di brodo di destrosio Sabouraud in una provetta conica sterile da 50 ml. Incubare per circa 24 ore a 30 °C sotto agitazione (200 giri/min).
- Non superare le 24 ore di incubazione. Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il tappo leggermente aperto per una migliore aerazione. È sempre bene standardizzare la fase di crescita delle cellule prima di ogni test, poiché questo è un fattore importante che influenza la resistenza antimicrobica><.
nota: Entrambi i funghi sono stati coltivati a 30 °C per una rapida propagazione nei nostri esperimenti, ma la temperatura può essere modificata per riflettere gli obiettivi dello studio, ad esempio il trattamento clinico (37 °C). Ancora più importante, questo tempo di incubazione iniziale dovrebbe essere stabilito in anticipo per ogni isolato fungino e mantenuto durante tutti i test per garantire la riproducibilità.
- Dopo la crescita fungina, raccogliere le cellule centrifugando le provette coniche a 1.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS.
- Risospendere le celle e centrifugare nuovamente a 1.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere il lavaggio PBS e la centrifugazione altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 5 mL (a seconda della dimensione del pellet) di terreno 2X RPMI-1640.
- Preparare 1 mL di diluizione 1:100 o 1:1.000 in una provetta da microcentrifuga (a seconda della torbidità della sospensione cellulare).
- Aliquotare 10 μL di questa diluizione, porla in una camera emocitometrica e contare al microscopio il numero totale di cellule nei quattro quadranti angolari. Calcolare la concentrazione con la formula: (numero totale di cellule/4) x fattore di diluizione x 104 (costante di diluizione della camera).
- Considerare una vitalità del 100% se i conteggi di vitalità e le condizioni di crescita sono stati sistematicamente correlati per l'isolato in studio.
nota: La standardizzazione e il controllo di qualità dei conteggi di vitalità possono essere effettuati mediante back-plating in conformità con il metodo della concentrazione minima inibitoria (MIC) antifungina (MIC) del Comitato europeo per i test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) per i lieviti.
- Se la correlazione crescita/vitalità non è stata stabilita per l'isolato in studio, misurare la vitalità fungina contando le cellule vive in un emocitometro con l'aiuto di coloranti che colorano selettivamente le cellule morte, come la floxina B11, il blu di tripano o il verde Giano. Utilizzare le cellule fungine per questo protocollo solo se la vitalità della popolazione a questo punto è del 90% o superiore.
NOTA: I coloranti morti/vivi potrebbero non funzionare bene con il fungo scelto. Si prega di testarli prima dell'uso. Ad esempio, il colorante blu di tripano non funziona bene con C. neoformans.
- Successivamente, preparare le sospensioni cellulari in terreno 2X RPMI-1640 (inoculo regolato 2X in terreno RPMI-1640). Per le piastre a 96 pozzetti, considerare un volume di 5 mL per ciascuna piastra.
- Per tutti i ceppi di C. albicans, preparare una sospensione madre di 4 x 103 cellule/mL. Questa concentrazione è 2 volte la concentrazione finale delle cellule in ciascun pozzetto (2 x 103 cellule/mL).
- Per i ceppi di C. neoformans, preparare una coltura stock di cellule 2 x 104 cellule/mL. Questa concentrazione è il doppio della concentrazione finale delle cellule in ciascun pozzetto (1 x 10,4 cellule/mL).
- Per altri funghi, testare con un antimicotico noto la cui concentrazione sarà ideale per lo studio particolare in relazione al tempo di incubazione. Prendi in considerazione il metabolismo e il tempo di duplicazione del fungo.
3. Peptidi (Agente Sconosciuto)
- Conservare i peptidi liofilizzati a -20 °C e scioglierli in acqua deionizzata prima di ogni esperimento. Il tempo massimo di conservazione una volta disciolto in acqua dipenderà dalla natura di ciascun peptide.
- Preparare aliquote di una concentrazione finale doppia rispetto a quella più alta testata nel saggio (2X). Idealmente, preparare un piccolo numero di aliquote con abbastanza peptide per un uso unico per evitare cicli di congelamento-scongelamento.
nota: La scelta della concentrazione dovrebbe essere basata sulla letteratura e sulle proprietà del peptide. Si consiglia di iniziare le diluizioni seriali con circa 100 μM di peptide, per poi diminuire o aumentare questo intervallo di concentrazione a seconda dei risultati ottenuti.
4. Antimicotici di riferimento (controlli positivi)
- Per quelli diluiti in acqua: preparare una soluzione 2X della concentrazione più alta dell'analisi (vedere Sezione 5: Dosaggio antimicotico per le fasi di diluizione).
- Per i ceppi di C. albicans, preparare una soluzione di 128 μg/mL di fluconazolo o 128 μg/mL di caspofungin. La concentrazione su piastra per entrambi sarà di 64 μg/mL.
- Per i ceppi di C. neoformans, preparare una soluzione di 32 μg/mL di amfotericina B (soluzione idrosolubile). La concentrazione su piastra sarà di 16 μg/mL.
NOTA: Normalmente l'amfotericina B viene diluita in dimetilsolfossido (DMSO), poiché questo antimicotico è scarsamente solubile in acqua. Tuttavia, esistono in commercio preparati idrosolubili di amfotericina B.
- Per gli antimicotici diluiti in un solvente organico: preparare una soluzione madre 100X in DMSO, quindi diluirla a 10X in acqua per l'uso.
nota: Pertanto, nel pozzo, la concentrazione finale di DMSO non supererà l'1%. Un pozzo in cui il fungo crescerà in terreni contenenti l'1% di DMSO come controllo è necessario dato che alcuni funghi non tollerano bene questa concentrazione del solvente. Ricorda che il DMSO è fotosensibile, quindi copri la piastra con un foglio di alluminio o mettila in una camera buia per tutta la durata del periodo di incubazione.
5. Dosaggio antimicotico
NOTA: I test antifungini in vitro vengono eseguiti sulla base del test di suscettibilità alla microdiluizione del brodo dalle linee guida M27-A3 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) con alcune modifiche.
- Preparare una diluizione seriale doppia di ciascun peptide e controllare l'antimicotico in micropiastre di polistirene a 96 pozzetti fino a un volume finale di 50 μl.
- Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 μl di antimicotico/peptide alla concentrazione 2X della concentrazione finale più alta desiderata nelle colonne 1-3, nella riga A.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 μl di acqua sterile negli altri pozzetti, nelle file da B a H.
- Rimuovere 50 μl dei pozzetti con la concentrazione più alta (fila A), trasferire al pozzetto successivo della concentrazione successiva (riga B) e omogeneizzare.
- Ripetere i passaggi precedenti fino al pozzetto con la concentrazione più bassa e scartare 50 μl di questo pozzetto (fila H). Lasciare le colonne 11 e 12 (righe A, B, C) con solo acqua per il controllo del bianco o per il controllo negativo/della crescita.
- Aggiungere 50 μL dell'inoculo 2X aggiustato in terreno RPMI-1640 a ciascun pozzetto (colonne 1-3 più colonna 11 (negativo/controllo della crescita)); la concentrazione finale per C. albicans sarà 2 x 103 cellule/mL e la concentrazione finale per i ceppi di C. neoformans sarà 104 cellule/mL.
- Preparare i controlli in bianco (50 μL di acqua + 50 μL di terreno 2X RPMI-1640 senza cellule) e il controllo negativo/di crescita (50 μL di acqua + 50 μL di inoculo regolato 2X terreno RPMI-1640 senza antimicotico) e caricare nella piastra a pozzetti come descritto sopra.
- Ripetere la procedura per ogni composto da testare e per il controllo antimicotico scelto (colonne 4-10).
nota: Le diluizioni seriali possono essere eseguite verticalmente come nell'esperimento sottostante o orizzontalmente nella piastra (cioè se il numero di diluizioni del composto/estratto dato che deve essere testato è otto o più).
- Se i composti, i farmaci di riferimento o uno qualsiasi dei suoi componenti sono fotosensibili, eseguire il test in condizioni di luce ridotta, coprire le piastre con un foglio di alluminio o collocarle in una camera buia durante le incubazioni.
- Prendi in considerazione le seguenti raccomandazioni facoltative.
- Sigillare la piastra con una piastra di copertura trasparente che consenta lo scambio di gas, in quanto ciò aiuta a ridurre l'evaporazione.
- Posizionare la piastra in una camera umida; aiuterà anche a ridurre l'evaporazione.
- Incubare le piastre a 37 °C per 24 ore o 48 ore per tutti i ceppi di C. albicans e per 48 ore con agitazione a 200 giri/min per C. neoformans. Il volume finale inferiore (100 μL) assicura che non si verifichi alcuna fuoriuscita.
nota: Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra le letture di MIC a 24 ore e 48 ore per i ceppi di C. albicans. Tuttavia, le letture a 48 ore sono più facili da visualizzare.
- Osservare tutti i pozzetti, con l'assistenza di un microscopio ottico invertito, prima e dopo il periodo di incubazione per verificare i cambiamenti nella morfologia e per verificare la presenza di segni di contaminazione.
nota: Le letture possono essere effettuate visivamente e fotografate alla fine dell'esperimento. Prima di ogni lettura, omogeneizzare leggermente la piastra. Le letture possono essere eseguite anche misurando il suo diametro esterno a 600 nm, se non si osservano grumi di cellule o filamentazione.
- Esegui gli esperimenti almeno tre volte in date separate.
Tabella 1. Preparazione dei terreni e dei reagenti.
| Medio | preparazione |
| 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio – 500 ml | 10,4 g di RPMI-1640 (addizionato con L-glutammina e rosso fenolo; senza bicarbonato) |
| 330 mM di acido 3-(N-morfinolino) propano solfonato (MOPS) |
| Regolazione a pH 7,0 con NaOH |
| Sterilizzare per filtrazione (filtro da 0,22 μM) |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | 137 mM di NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| Autoclavare in autoclave a 121°C per 15 minuti. |
| Brodo di destrosio Sabouraud | 15 g di polvere in 500 ml di acqua distillata. |
| Regolazione a pH 7,0 con NaOH |
| Autoclavare in autoclave a 121°C per 15 minuti. |
| Sabouraud Agar destrosio | 32,5 g di polvere in 500 ml di acqua distillata. |
| Regolazione a pH 7,0 con NaOH |
| Autoclavare in autoclave a 121°C per 15 minuti. |