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1. Quantificazione della fattibilità delle aggregazioni GC
- Raccogliere il GC utilizzando un applicatore sterile. Tamponare il GC dalla piastra e risospendere il GC in brodo preriscaldato (GCP, Tabella 1) integrato con soluzioni di NaHCO3 al 4,2% e Kellogg all'1%. Utilizzare la spettrofotometria a una lunghezza d'onda di 650 nm (un OD 650 di 1 = ~1 x 109 CFU/mL) per determinare la concentrazione di batteri sospesi.
- Regolare la concentrazione di GC a ~1 x 108 CFU/mL.
- Aggiungere 99 μL di sospensione GC regolata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra per 6 ore a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire ai batteri di aggregarsi.
- Aggiungere 1 μL di ceftriaxone diluito in serie (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/mL) in ciascun pozzetto. Lasciare alcuni pozzetti non trattati per fungere da controlli.
- Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C con CO2 al 5%.
- Sonicare la sospensione 3 volte in ogni pozzetto per 5 s a 144 W e 20 kHz.
- Aggiungere 100 μl di reagente bagliore per l'utilizzo di ATP disponibile in commercio in ciascun pozzetto, pipettare su e giù per 3 volte e incubare per 15 minuti a 37 °C con CO2 al 5%.
- Trasferire con cautela 150 μl di miscela da ciascun pozzetto in un nuovo pozzetto in una micropiastra nera a 96 pozzetti ed evitare l'introduzione di bolle.
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nm utilizzando il lettore di piastre.
- Calcolare il tasso di sopravvivenza in base al rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento seriale con ceftriaxone e la lettura da pozzetti non trattati.
2. Analisi microscopica a fluorescenza di aggregati GC vivi/morti
- Raccogliere il GC utilizzando un applicatore sterile. Tamponare il GC dalla piastra e risospendere il GC in un terreno GCP preriscaldato più l'1% di integratori Kellogg.
- Determinare il numero di batteri mediante spettrofotometria a una lunghezza d'onda di 650 nm e regolare la concentrazione di GC a ~1 x 107 CFU/mL.
- Aggiungere 198 μl di sospensione GC in camere a fondo coprioggetto a 8 pozzetti.
- Incubare la camera per 6 ore a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire la formazione dell'aggregazione.
- Aggiungere 2 μL di ceftriaxone (100 μg/mL o varie diluizioni) in ciascun pozzetto entro ciascuna condizione di aggregazione. Incubare per il tempo desiderato a 37 °C con il 5% di CO2.
- Aggiungere 0,6 μl di soluzione colorante viva/morta in ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 °C con il 5% di CO2.
- Acquisizione di immagini della serie Z utilizzando un microscopio confocale (è possibile utilizzare un microscopio equivalente).
- Analizza le immagini utilizzando il software ImageJ per misurare le dimensioni degli aggregati GC e il rapporto di intensità della fluorescenza FIR della colorazione vivo-morto in ciascun aggregato.
Tabella 1: Ricetta per 1 L di terreno di crescita batterica GCP.
