Determinazione del ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella sensibilità delle cellule di linfoma a un farmaco in esame

Abstract

Fonte: Hirz, T., et al. Isolamento e analisi dei neutrofili per determinare il loro ruolo nella sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti terapeutici. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un test che indaga il ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella salvaguardia delle cellule di linfoma contro la citotossicità degli agenti chemioterapici. Una co-coltura 3D, costituita da linfoma e cellule simili ai neutrofili, viene stabilita ed esposta alla vincristina, un farmaco chemioterapico. Il contatto diretto con le cellule simili ai neutrofili induce una sovraregolazione delle proteine anti-apoptotiche nelle cellule del linfoma, favorendo così la loro sopravvivenza in presenza di vincristina.

Protocollo

1. Differenziazione delle cellule HL60 lungo la via granulocitaria e loro cocoltura con cellule B di linfoma RL in modello 3D

1. Differenziazione di cellule promielocitiche umane (HL60) in cellule simili ai neutrofili
   1. Regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10,⁵ cellule/ml, quindi aggiungere 1 μM di acido retinoico (RA) e 1,25% di DMSO per indurne la differenziazione. Seminare ciascuna 3 x 10⁵ cellule HL60 per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti, quindi incubare per 48 ore a 37 °C con il 5% di CO₂.
   2. Successivamente, raccogliere le cellule e centrifugarle a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con un mezzo RPMI completo per il conteggio utilizzando il contatore di vitalità cellulare.
   3. Quindi diluire la sospensione cellulare in un mezzo RPMI completo per regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10⁵ cellule/ml e indurre nuovamente la loro differenziazione aggiungendo 1 μM di acido retinoico (RA) e 1,25 % di dimetilsolfossido (DMSO). Seminare ogni 3 x 10⁵ cellule HL60 per pozzetto in una piastra a 48 pozzetti e incubare per altre 48 ore a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Analisi della differenziazione di HL60 (HL60diff)
   1. Raccogliere le cellule e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere il pellet con un terreno completo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) per il conteggio utilizzando il contatore di vitalità cellulare.
   2. Analizzare i cambiamenti nell'espressione dei marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Posizionare ciascuna 3 x 10,⁵ cellule HL60 indifferenziate (da coltura cellulare) e 3 x 10,⁵ cellulediff HL60 in provette di plastica da 5 ml per l'analisi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT.
   3. Risospendere i pellet in 50 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-Siero fetale bovino (FBS) (4%). Marcare le cellule con CD11b anti-umano coniugato a AF700 o CD38 anti-umano coniugato a APC (5 μl/10⁶ cellule). Incubare le cellule al buio per 30 minuti a 4 ^oC.
   4. Lavare con 500 μl di PBS-FBS (4%), quindi centrifugare a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere i pellet in 200 μl di PBS-FBS (4%).
   5. Analisi su citometro a flusso utilizzando la strategia di gating della Figura 1A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP); laser a 633 nm: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Per testare i cambiamenti morfologici in HL60diff, immobilizzare le cellule su vetrini per l'esame microscopico.
      1. A tale scopo, risospendere ciascuna 3 x 10⁴ cellule HL60 indifferenziate (da coltura cellulare) e 3 x 10⁴ HL60 diff in un terreno RPMI completo da 150 μl. Assemblare i vetrini, le schede filtranti e le camere dei campioni nella centrifuga cytospin, assicurandosi che la centrifuga sia bilanciata.
      2. Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e nella citocentrifuga a 1.500 giri/min per 10 minuti a RT. Rimuovere i vetrini, le schede filtranti e le camere del campione dalla centrifuga. Smontare con cura, in modo da non danneggiare le celle sul vetrino. Scartare le schede filtranti e le camere di campionamento.
      3. Colorare le celle utilizzando il kit di colorazione Giemsa e conservare i vetrini per 1 ora ad asciugare. Esamina le cellule al microscopio con ingrandimento 100X.
3. Cultura tridimensionale (3D<br /> nota: Assicurarsi che i materiali utilizzati in questo esperimento siano freddi e che l'esperimento si svolga sul ghiaccio.
   1. Risospendere ciascuna 5 x 10⁴ cellule RL, da sole o miscelate con HL60diff al rapporto RL:HL60diff 1:10, con una matrice di membrana basale da 300 μl utilizzando il puntale della pipetta da 1 ml tagliato con una forbice sterile per allargare l'apertura a circa 2 o 3 mm. Evitare la formazione di bolle durante questa fase.
   2. Seminare ogni 300 μl di sospensione cellulare/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Evita le bolle durante questo passaggio. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C con CO₂ al 5%, quindi aggiungere 1 ml di terreno RPMI completo per ogni pozzetto e incubare per 7 giorni a 37 °C con CO₂ al 5%. Cambia il mezzo ogni due giorni. Aggiungere 10 nM di vincristina al giorno 5.
4. Analisi FACS
   1. Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS ghiacciato due volte. Aggiungere 3 ml/pozzetto di acido PBS-etilendiamminotetraacetico ghiacciato (EDTA) (5 mM). Staccare il gel dal fondo del pozzetto raschiando con il fondo del puntale della pipetta da 200 μl. Agitare delicatamente la piastra con ghiaccio per 30 minuti.
   2. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 ml e agitare delicatamente le provette con ghiaccio per altri 30 minuti. Verificare l'aspetto di una sospensione cellulare omogenea. (In caso contrario, agitare le celle più a lungo o aggiungere più PBS-EDTA).
   3. Centrifugare le provette a 300 x g per 10 minuti a RT. Lavare i pellet con PBS e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a RT.
   4. Risospendere con PBS-FBS (4%) e marcare con anticorpo anti-umano CD19 coniugato a PE-Cy7 e anticorpo anti-umano CD38 coniugato ad APC (5 μl/10⁶ cellule). Incubare al buio per 30 minuti a 4 ^oC.
   5. Lavare con 500 μl di PBS-FBS (4%), quindi centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con l'annessina V e il PI utilizzando il kit commerciale.
   6. Analizzare su citometro a flusso utilizzando la strategia di gating della Figura 2A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); laser a 633 nm: APC (660/20 BP). Garantire la compensazione del colore.

Risultati

Figura 1. Parametri strutturali delle cellule HL60 differenziate. (A) I grafici a diffusione diretta (FSC) e a dispersione laterale (SSC) rappresentano le cellule HL60 e le cellule HL60 differenziate (HL60diff). (B) Le cellule HL60 e HL60diff sono state marcate con anti-CD11b-AF700 o anti-CD38-APC seguite da analisi di citometria a flusso. Dopo aver...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	Codice 21875-034
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco Invitrogen	Codice 10270-106
Soluzione salina tamponata con fosfato (il PBS contiene calcio e magnesio)	Gibco Invitrogen	Codice 14040-091
Vincristine	EG labo
Matrice a membrana basale BD Matrigel	BD Bioscienze	354234	Mettere a 4 oC per una notte prima del giorno dell'esperimento
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Acido retinoico	Sigma-Aldrich	Codice: R2625
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	Codice: A7906
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Kit di colorazione V-FLOUS di annessione	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Kit di colorazione Giemsa modificato	Cosmos Biomedicale	CB361550-0000
Citometria a flusso LSRII	BD Bioscienze
Citocentrifuga	Termo Scientifico
Microscopio Leica DMR-XA	Leica Microsystems
Cellometro Contatore automatico di vitalità cellulare T4	Nexcelom Bioscienze