Un test per valutare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T

Abstract

Fonte: Choi, J. et al., Adattamento dei saggi di citotossicità in vivo per studiare l'immunodominanza nelle risposte delle cellule T CD8⁺ specifiche per il tumore. J. Vis. Exp. (2019)

Il video mostra un test basato sulla citometria a flusso per analizzare l'immunodominanza nei linfociti T citotossici o le risposte CTL. Le cellule bersaglio fluorescenti iniettate mostrano una fluorescenza variabile corrispondente agli epitopi immunogenici. La raccolta e lo smistamento post-milza rivelano una riduzione delle cellule fluorescenti ad alta intensità, confermando l'immunodominanza nelle risposte CTL.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Inoculazione di topi C57BL/6 con cellule tumorali che esprimono T Ag

1. Coltivare la linea cellulare di fibrosarcoma trasformata SV40 C57SV (o una linea cellulare aderente simile a T Ag⁺) nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L di D-glucosio e L-glutammina (1x) e integrata con 1 mM di piruvato di sodio e siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente al 10% in fiasche trattate con coltura tissutale a 37 °C in atmosfera umidificata contenente il 10% di anidride carbonica (CO₂).
2. Una volta che le cellule diventano completamente confluenti o leggermente sovraconfluenti, rimuovere delicatamente e scartare il terreno e risciacquare il monostrato con soluzione fisiologica sterile (PBS) preriscaldata.
   NOTA: La massima espressione di T Ag si ottiene quando le cellule T Ag⁺ raggiungono il 100% di confluenza.
3. All'interno di una cabina di sicurezza biologica, aggiungere acido tripsina-etilendiamminotetraacetico preriscaldato (tripsina-EDTA) (0,25%) per coprire il monostrato a temperatura ambiente fino a quando le cellule non si sono rimosse in chiazze. Picchiettare più volte i lati del pallone o dei matracci di coltura per rilasciare le cellule aderenti rimanenti.
   NOTA: Se necessario e per accelerare il processo di tripsinizzazione, trasferire il pallone o i matracci in un incubatore a 37 °C. Le cellule rimosse adotteranno rapidamente una forma arrotondata al microscopio ottico. Questo passaggio dovrebbe durare circa 5 minuti.
4. Aggiungere 5 mL di terreno DMEM e dissociare i grumi per preparare una sospensione a singola cellula pipettando il contenuto di ciascun pallone su e giù.
5. Trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare con pori da 70 μm in una provetta.
6. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in 10 mL di PBS sterile e freddo.
8. Ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 due volte.
9. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Preparare una sospensione uniforme contenente 4 x 10⁷ cellule/mL di PBS sterile.
10. Iniettare 500 μl della sospensione di cui sopra per via intraperitoneale (i.p.) in ciascun topo adulto (6-12 settimane) maschio o femmina C57BL/6
.

2. Regimi di trattamento

1. Regime di trattamento per esaminare il contributo delle cellule nTreg all'immunodominanza T_CD8
   1. Quattro giorni prima del priming in vivo di topi C57BL/6 con cellule C57SV (passaggio 1.10), iniettare ogni animale una volta i.p. con 0,5 mg di un anticorpo monoclonale (mAb) anti-CD25 a basso contenuto di endotossine e privo di azide (clone PC-61.5.3), che esaurisce le cellule nTreg, o con un controllo dell'isotipo IgG1 di ratto (ad esempio, clone KLH/G1-2-2, clone HRPN o clone TNP6A7).
2. Regime di trattamento per testare il significato in vivo delle interazioni programmate delle proteine della morte cellulare (PD-1-PD-L1(2)) nella formazione dell'immunodominanza T_CD8
   NOTA: L'impegno di PD-1 da parte di PD-L1 spesso, ma non sempre, media la co-inibizione e/o l'esaurimento del T_CD8 Ag-specifico. Pertanto, il trattamento con anti-PD-1 può essere eseguito in parallelo con la somministrazione di anticorpi monoclonali anti-PD-L1 e anti-PD-L2 per rivelare l'esatta interazione intercellulare coinvolta in un fenomeno biologico.

3. Preparazione degli splenociti bersaglio

1. Eutanasia di topi C57BL/6 naïve (6-12 settimane di età) che fungeranno da donatori di splenociti per lussazione cervicale.
2. Posiziona ogni topo con l'addome rivolto verso l'alto all'interno di una cabina di sicurezza biologica. Spruzzare sulla pelle con etanolo al 70% (v/v), EtOH. Usando pinze e forbici sterili, sollevare la pelle e praticare una piccola incisione ventrale sulla linea mediana. Quindi, taglia la pelle a forma di croce per esporre il peritoneo.
3. Usando una pinza, solleva il peritoneo come una tenda senza strappare nessuno degli organi interni. Tagliare il peritoneo per esporre la cavità peritoneale e rimuovere delicatamente la milza.
4. Posizionare la milza o le milze all'interno di un macinatore di tessuti Dounce da 15 ml contenente 5 ml di PBS sterile. Applicare una pressione manuale utilizzando lo stantuffo di vetro del macinatore fino a quando il tessuto splenico non si dissipa in una sospensione cellulare omogenea rossa.
   NOTA: A seconda del numero di animali riceventi per gruppo sperimentale, potrebbero essere necessarie diverse milze di topo donatore per la preparazione delle cellule bersaglio. Fino a 3 milze possono essere omogeneizzate insieme all'interno di un macinatore da 15 ml.
5. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
6. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in 4 mL di tampone lisanti ammonio-cloruro-potassio (ACK) per 4 minuti per eliminare gli eritrociti.
   NOTA: si tratta di un passaggio sensibile al fattore tempo. La sovraesposizione degli splenociti al tampone di lisi ACK aumenterà la loro fragilità e li renderà suscettibili alla morte cellulare aspecifica.
7. A ciascuna provetta, aggiungere 8 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) contenente il 10% di FBS inattivato termicamente, L-alanil-L-glutammina, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali (MEM) di terreni essenziali minimi, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) e 1x penicillina/streptomicina, che di seguito sarà indicato come terreno RPMI completo (Tabella dei materiali).
8. Trasferire il contenuto attraverso i pori da 70 μm di un filtro cellulare in una nuova provetta da 15 mL.
9. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
10. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule pellettate in 12 mL di RPMI completo.
11. Dividere la sospensione di splenociti in 3 porzioni uguali (4 mL ciascuna) in 3 provette separate.

4. Rivestire gli splenociti bersaglio con peptidi irrilevanti e affini

1. Etichettare le provette in base ai peptidi che verranno utilizzati per pulsare gli splenociti bersaglio. Gli splenociti di controllo saranno pulsati con un peptide irrilevante e ogni popolazione di splenociti bersaglio affini sarà pulsata con un peptide sintetico corrispondente all'epitopo immunodominante derivato da T Ag (sito IV) o a un epitopo sottodominante di T Ag (sito I o sito II/III) (Tabella 1).
   NOTA: La scelta dei peptidi irrilevanti dipende dal set-up sperimentale e dal ceppo di topo utilizzato in ciascuna indagine. Gli autori usano spesso gB_498-505 (un epitopo peptidico immunodominante H-2K^b-restricted del virus dell'herpes simplex [HSV]-1) e/o GP_33-41 (un epitopo peptidico immunodominante H-2D^b-restricted del virus della coriomeningite linfocitaria ([LCMV]) nei topi C57BL/6 (Tabella 1). Questi peptidi sono scelte ottimali perché: (i) derivano da agenti patogeni non precedentemente incontrati nel modello murino qui descritto; (ii) analogamente ai peptidi derivati da T Ag, gB_498-505 e GP_33-41 sono limitati e si legano alle molecole^{H-2 b}. Nei saggi di uccisione in vivo "a tre picchi", ciascuno dei due picchi che corrispondono a cellule bersaglio affini può rappresentare splenociti pulsati con un peptide immunodominante o subdominante. La scelta di ciascun set di peptidi varia in base agli obiettivi di ciascun esperimento. Vedere la Figura 1 e la Figura 2 come esempi di tale variazione. Per il resto di questo protocollo, i siti I e IV derivati da T Ag rappresenteranno rispettivamente peptidi subdominanti e immunodominanti.
2. Pulsare il contenuto di ciascuna provetta marcata con 1 μM del rispettivo peptide per 1 ora a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Utilizzare un filtro a celle separato (con pori da 70 μm) per ciascuna provetta per rimuovere grumi e detriti, se necessario.
4. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
5. Risospendere le cellule pellettate in 12 mL di PBS freddo sterile e ripetere ancora una volta il passaggio 4.4.
   NOTA: È importante rimuovere il più possibile FBS perché FBS può legare la carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) nel passaggio successivo.

5. Etichettatura degli splenociti bersaglio con CFSE

1. Risospendere gli splenociti pulsati con peptidi in 4 mL di PBS sterile.
2. Aggiungere CFSE a 0,025 μM, 0,25 μM e 2 μM nelle provette contenenti rispettivamente splenociti pulsati con peptidi, sito I e sito IV irrilevanti.
   NOTA: Per ottenere un'etichettatura CFSE uniforme, tenere ciascuna provetta a un angolo di 45° prima di aggiungere CFSE sul lato leggermente sopra la sospensione cellulare, seguita immediatamente da un leggero vortice. Ciò garantirà la comparsa di istogrammi lisci alla fine. Le variazioni da lotto a lotto e dipendenti dall'età nelle intensità di CFSE non sono rare. Pertanto, potrebbe essere necessario sperimentare dosi differenziali di CFSE prima di decidere le concentrazioni ottimali da utilizzare.
   cautela: Il CFSE è tossico a concentrazioni superiori a 5 μM.
3. Posizionare le provette all'interno di un'incubatrice a 37 °C per 15 minuti e capovolgerle una volta ogni 5 minuti.
4. Aggiungere 3 mL di FBS inattivato a caldo in ciascuna provetta per arrestare la reazione CFSE. Rabboccare il contenuto con PBS sterile.
5. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
6. Risospendere le cellule pellettate in 12 mL di PBS sterile e ripetere il passaggio 5.5.

6. Esame dell'etichettatura CFSE adeguata/uguale delle popolazioni di splenociti target

1. Risospendere le cellule pellettate in 3 mL di PBS.
2. Agitare delicatamente i tubi. Trasferire 10 μl ciascuno di sospensioni cellulari CFSE^bassa, CFSE^{intermedia (int)} e CFSE^alta in una provetta di smistamento cellulare attivata da fluorescenza (FACS) in polistirene a fondo tondo da 5 mL contenente 200 μL DI PBS.
3. Interrogare le cellule utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nm. Disegna un gate linfocitario in base alle proprietà di dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) delle cellule prima di acquisire 5000 eventi che rientrano all'interno del cancello linfocitario nel canale FL-1.
4. All'interno della popolazione CFSE⁺ "genitrice", disegna ulteriori porte dell'istogramma per identificare le sottopopolazioni CFSE^bassa, CFSE^int e CFSE^alta.
5. Conferma i numeri di evento uguali o quasi uguali all'interno dei tre cancelli. Se necessario, regolare il numero di cellule nelle provette "sorgente" (passaggio 6.1) prima di miscelare e iniettare gli splenociti bersaglio in topi naïve e innescati nella sezione 7.

7. Iniezione di cellule bersaglio marcate con CFSE in riceventi naïve e T-Ag-primed

1. Agitare delicatamente i tubi di origine. Trasferire le tre sospensioni cellulari marcate con CFSE in rapporti uguali in una nuova provetta.
2. Rabboccare il contenuto con PBS sterile.
3. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule pellettate con PBS sterile.
4. Contare le cellule in blu di tripano con un emocitometro per garantire una vitalità cellulare di almeno il 95%.
5. Regolare il volume in modo da iniettare 1 x 10⁷ cellule bersaglio miste/200 μL di PBS per via endovenosa (e.v.), attraverso la vena caudale, in ciascun topo C57BL/6 ricevente.
   NOTA: Conservare le cellule sul ghiaccio tra un'iniezione e l'altra. Mescolare delicatamente le cellule bersaglio prima di ogni iniezione. Registra l'ora esatta dell'iniezione per ogni topo, che determinerà quando l'animale dovrà essere soppresso. È importante mantenere costante la durata della citotossicità in vivo tra tutti gli animali nello stesso esperimento.

8. Acquisizione dati

1. Due o quattro ore dopo l'iniezione di cellule bersaglio marcate con CFSE, sopprimere i topi riceventi mediante lussazione cervicale.
   NOTA: La durata della citotossicità in vivo può variare a seconda del sistema sperimentale impiegato, dell'immunogenicità degli Ag bersaglio, dell'abbondanza prevista di T_CD8 peptidico antigene-specifico nella milza e della robustezza della loro funzione litica, tra gli altri fattori.
2. Rimuovere e lavorare ogni milza separatamente come nei passaggi 3.2-3.9.
3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 3 mL di PBS.
   NOTA: Prestare particolare attenzione a maneggiare il tessuto splenico e le preparazioni cellulari a 4 °C o su ghiaccio prima delle analisi citofluorimetriche. Questo per prevenire la citotossicità continua ex vivo.
4. Trasferire circa 1x10⁷ cellule da ciascuna milza lavorata in una provetta FACS pulita.
5. Interroga immediatamente le cellule utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nm. Disegnare un cancello linfocitario in base alle proprietà FSC e SSC delle cellule.
6. Identificare gli splenociti del ricevente di CFSE e le cellule bersaglio trasferite da CFSE⁺. Disegna porte aggiuntive che ospitano popolazioni di cellule target CFSE^basse, CFSE^int e CFSE^alte.
7. Acquisisci un totale di 2000 eventi^{CFSE low} nel canale FL-1.

9. Analisi dei dati

1. Calcolare la lisi specifica di ciascuna popolazione di cellule bersaglio affini utilizzando la seguente formula:
   % Citotossicità specifica =
   dove x = CFSE^int/alto numero di eventi nel topo T Ag-innescato, y = CFSE^basso numero di eventi nel topo T Ag-innescato, a = CFSE^int/alto numero di eventi nel topo naïve e b = CFSE^basso numero di eventi nel topo naïve.
   nota: Nei saggi di citotossicità "a tre picchi" in cui viene valutata la lisi specifica di più di una popolazione target affine, non è opportuno utilizzare le frequenze delle cellule target. Ciò è semplicemente dovuto al fatto che la frequenza di una popolazione di cellule bersaglio affini è influenzata non solo dalla percentuale dei controlli irrilevanti, ma anche da quella degli altri splenociti bersaglio affini. Pertanto, i numeri di evento all'interno di ciascun gate devono essere utilizzati nella formula di cui sopra per calcolare accuratamente la lisi di ciascuna popolazione di cellule bersaglio affini (CFSE^int o CFSE^high cells) rispetto ai controlli^{CFSE low}.

Tabella 1. Peptidi introdotti in questo protocollo.

Fonte di antigene proteico	Epitopo peptidico	designazione	sequenza	Restrizione MHC I
SV401 T Aggrande 2	T Ag206-215	Sito I	SAINNYAQKL	H-2Db
SV40 Large T Ag	T Ag223-231	Sito II/III	CKGVNKEYL	H-2Db
SV40 Large T Ag	T Ag404-411	Sito IV	VVYDFLKC	H-2Kb
SV40 Large T Ag	T Ag489-497	Sito V	QGINNLDNL	H-2Db
HSV-13 Glicoproteina B	gB498-505*	gB498-505	SSIEFARL	H-2Kb
Glicoproteina LCMV4	GP33-41*	GP33-41	KAVYNFATC	H-2Db
1Virus delle scimmie 40
2Antigene tumorale di grandi dimensioni
3Virus dell'Herpes Simplex tipo 1
4Virus della coriomeningite linfocitaria
*utilizzato come peptide irrilevante

Risultati

Figura 1: Analisi citofluorimetrica rappresentativa della citotossicità mediata da T_CD8 contro epitopi derivati da T Ag in presenza o assenza di cellule nTreg. Gli splenociti bersaglio pulsati con peptidi di controllo, sito I o sito IV, che sono stati marcati in modo differenziale con CFSE, sono stati monitorati mediante citometria a flusso nella milza di un topo naïve (pannello di sinistr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina-EDTA (1X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 25200-056
ACK Tampone di lisi	Thermo Fisher Scientifico	A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)	Cellula Bio X	BE0012
Anti-topo PD-1 (clone RMP1-14)	Cellula Bio X	BE0146
CFSE	Thermo Fisher Scientifico	Codice C34554
DMEM (1X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11965-092
Siero fetale bovino (FBS)	Wisent Bioproducts	080-150	Inattivare a caldo prima dell'uso
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 35050-061
HEPES (1M)	Thermo Fisher Scientifico	15630080	Concentrazione finale di 10 mM
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (100X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11140-050
Penicillina/Streptomicina	Sigma-Aldrich	P0781	Lo stock è 100X
IgG1 di ratto (clone KLH/G1-2-2)	Biotecnologie meridionali	Codice 0116-01	Controllo degli isotipi
IgG1 di ratto (clone HRPN)	Cellula Bio X	BE0088	Controllo degli isotipi
IgG1 di ratto (clone TNP6A7)	Cellula Bio X	BP0290	Controllo degli isotipi
IgG2a di ratto (clone 2A3)	Cellula Bio X	BP0089	Controllo degli isotipi
RPMI 1640 (1X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11875-093
Piruvato di sodio (100 mM)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11360-070	Concentrazione finale di 1 mM