Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

Nota: Il plasmide utilizzato Lifeact-mCherry è un gentile dono del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parigi.

1. Celle e Trasfezione

Nota: i macrofagi RAW264.7 vengono coltivati fino alla subconfluenza in terreno completo (terreno RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM piruvato di sodio, 50 μM β-mercaptoetanolo, 2 mM di L-glutammina e 10% FCS (siero fetale di vitello)) in una piastra da 100 mm. Vengono trasfettati con plasmidi che codificano proteine marcate in fluorescenza mediante elettroporazione. Di routine vengono trasfettate circa 5 - 6 x 10⁶ cellule con 20 μg o 10 μg di plasmide per ogni trasfezione o co-trasfezione, rispettivamente. Si noti che altri mezzi di trasfezione basati sull'elettroporazione o sulla lipofezione possono essere utilizzati come approcci alternativi.

1. Raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e risospenderle in 10 ml di terreno di coltura pipettando su e giù più volte.
2. Centrifugare la sospensione della cella 300 x g, 5 min a RT in rotore ad angolo oscillante.
3. Preriscaldare 10 ml di terreno completo integrato con 10 μg/ml di gentamicina a 37 °C.
4. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di "tampone di lavaggio A" dal kit di elettroporazione.
5. Centrifugare la sospensione della cella 300 x g, 5 min a temperatura ambiente in rotore ad angolo oscillante.
6. Nel frattempo preparare la miscela di DNA a temperatura ambiente: 120 μl 2x Buffer B, 20 μg di DNA plasmidico codificante per la proteina di interesse, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Dopo la centrifugazione, scartare l'intero surnatante.
8. Risospendere il pellet cellulare nella miscela di DNA e trasferirlo in cuvette per elettroporazione da 4 mm.
9. Incubare a RT per 3 min.
10. Elettroporato a 250 V, 900 μF.
11. Risospendere immediatamente le cellule nel terreno completo preriscaldato (37 °C) integrato con gentamicina e piastrarle in una piastra da 100 mm.
12. Incubare le cellule trasfettate per una notte a 37 °C, 5% CO₂.
13. La mattina successiva, sostituire il terreno completo con 10 ml di terreno di microscopia privo di siero (RPMI 1640 senza rosso fenolo, 10 mM HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μM di β-mercaptoetanolo, 2 mM di L-glutammina).

2. Opsonizzazione dei globuli rossi

Nota: Come modello di bersaglio particellare per i macrofagi, vengono utilizzati i globuli rossi di pecora (SRBC). Di solito, si utilizzano circa 7 x 10⁶ SRBC per piatto con fondo in vetro da 35 mm.

1. Lavare gli SRBC con 100 μl di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)/0,1% BSA (albumina sierica bovina) e centrifugare (600 x g, 4 min).
2. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere gli SRBC in 100 μl di 1x PBS/0,1% BSA e centrifugare (600 x g, 4 min).
3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere gli SRBC in 1x PBS/0,1% BSA con anti-SRBC IgG di coniglio a concentrazione sub-agglutinante. Utilizzare 500 μl di soluzione contenente anticorpi/5 μl di SRBCs.
   nota: La concentrazione sub-agglutinante di anticorpi corrisponde alla concentrazione più bassa che non ha indotto l'agglutinazione rilevata come formazione di una rete. In generale, la concentrazione sub-agglutinante è di 8,2 μg/ml.
   1. Determinare la concentrazione di IgG anti-SRBC necessaria per opsonizzare gli SRBC mediante un test di emoagglutinazione. Diluire in serie le IgG anti-SRBC (stock a 13,1 mg/ml) tra 1/50 e 1/25.600 in una micropiastra. Aggiungere 2 x 10⁶ SRBC in ogni pozzetto. Incubare la piastra al buio a RT per diverse ore.
4. Incubare a RT per 30 minuti con rotazione lenta.
5. Dopo due lavaggi in 1x PBS/0,1% BSA come descritto sopra, risospendere le SRBC opsonizzate con IgG (IGG-SRBC) in un mezzo di microscopia preriscaldato senza siero (2 ml/piatto).

3. Rivestimento in polilisina dei vetrini coprioggetti

1. Nel frattempo, trattare le stoviglie con fondo di vetro da 35 mm con 2 ml di poli-L-lisina allo 0,01% per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare i piatti due volte con 2 ml di 1x PBS.

4. Fissazione non covalente di SRBC su piatti con fondo di vetro

1. Versare 2 ml di sospensione di SRBCs per piatto con fondo in vetro da 35 mm.
2. Centrifugare con rotore oscillante a 500 x g per 2 minuti su piastre con fondo di vetro da 35 mm.
3. Rimuovere il surnatante e lavare una volta con 2 ml di 1x PBS/10% BSA.
4. Incubare le particelle per 30 minuti con 2 ml di 1x PBS/10% BSA per piatto.
5. Lavare i piatti tre volte con 2 ml di 1x PBS.
6. Sostituire 1x PBS con 2 ml di terreno per microscopia preriscaldato (37 °C) privo di siero.

5. Fagocitosi visualizzata da TIRFM

1. Microscopio
   nota: La TIRFM è stata eseguita utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo a immersione in olio (N 100X, NA1.49), una camera di riscaldamento con CO₂ e due telecamere di rilevamento a singolo fotone EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) accoppiate a una lente 1.5X.
   1. Il giorno prima della sessione al microscopio TIRF, accendere la camera di riscaldamento a 37 ºC per consentire un riscaldamento omogeneo del tavolino del microscopio.
2. Determinazione dell'angolo critico
   nota: Il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare flussi di immagini TIRF.
   1. Posizionare al microscopio una capsula con fondo di vetro da 35 mm contenente SRBC opsonizzato con terreno di microscopia privo di siero.
   2. Raschiare le cellule e risospenderle nel terreno prima di aggiungerle (100 - 500 μl) nel piatto.
   3. Utilizzare il software "Live Acquisition" per controllare il microscopio ed eseguire l'eccitazione con un laser a 491 nm e/o 561 nm per identificare le cellule che esprimono proteine marcate in fluorescenza.
   4. Identificare una cellula che esprime le proteine marcate in fluorescenza.
   5. Posizionalo al centro del campo e acquisisci 500 immagini a una lunghezza d'onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0º fino a 5º, con un incremento di 0,01º (Figura 1A). Gli angoli vengono modificati automaticamente dal sistema di microscopio.
   6. Determinare l'angolo critico che consente alla luce incidente di essere totalmente riflessa all'interfaccia vetro/fluido e generare l'onda evanescente. Utilizzando il software ImageJ Color Profiler, aprire la sequenza di immagini facendo clic su "File", "Apri" e selezionare il file.
   7. Selezionare una regione di interesse (ROI), con lo strumento rettangolare, nella cella con una fluorescenza uniforme (Figura 1B giallo 1).
   8. Traccia l'intensità media di fluorescenza del "Profilo dell'asse Z" misurata nel ROI con funzione degli angoli sull'asse x cliccando sulla scheda "Immagine", "Pile" nel menu a discesa e "Traccia il profilo dell'asse Z" (Figura 1B rosso 2).
      Nota: l'angolo critico è l'angolo che porta alla fluorescenza massima prima di una brusca diminuzione della fluorescenza.
   9. Utilizzare qualsiasi valore dell'angolo sull'asse x superiore all'angolo critico durante la sessione di microscopia per ottenere un segnale TIRF come esempio 2.00 (Figura 1C).
3. Acquisizioni
   1. Utilizzando il software Live Acquisition, impostare i parametri di acquisizione con il modulo "Editor di protocollo" (Figura 2A).
      1. Creare un protocollo con un "loop" comprendente l'acquisizione di "Multi Canali" per acquisire il segnale fluorescente da proteine di interesse nella regione TIRF. Inserire l'angolo TIRF (ad esempio 2,00), il tempo di esposizione (ad esempio 50 msec) e l'intensità del laser (ad esempio 50%) (Figura 2B 1).
      2. Introdurre un "movimento Z" dell'obiettivo 3 μm sopra la regione TIRF per ottenere l'acquisizione del segnale in epifluorescenza con lo strumento "Multi Channels". Inserire un angolo al di sotto dell'angolo critico (come ad esempio 1,00), del tempo di esposizione (50 msec) e dell'intensità laser (50%) (Figura 2B, 2 e 3).
      3. Quindi aggiungere una "mossa z" dell'obiettivo 3 μm sottostante, per tornare nella regione TIRF (Figura 3B 4). Aggiungere un'"istantanea" della cella in un LED a luce intensa (diodo a emissione luminosa) (Figura 2B 5).
   2. Trova una cellula di interesse con un livello moderato di espressione proteica marcata in fluorescenza che avvia la fagocitosi di SRBC estendendo la membrana plasmatica attorno alla particella.
   3. Posizionalo al centro del campo.
   4. Inizia l'acquisizione in streaming di 500 - 1.000 fotogrammi. Nella scheda "conteggio loop", immettere "750 frames" (Figura 2B 1).
      nota: Il software ImageJ Color Profiler viene utilizzato per elaborare flussi di immagini TIRF.
   5. Apri le immagini della sequenza nel software Image J facendo clic su "File", "Apri" e scegliendo il file.
   6. Separare i canali facendo clic sulla scheda "Immagine", sul menu a discesa "Hyperstacks" e sulla funzione "Stack to hyperstack". Completa la finestra visualizzata: Ordine: xyctz; Canale (c): numero di canali (es: "2" se si hanno due fluorocromi); Fette (z): numero di fette sull'asse z (es: "1" se non c'è movimento sull'asse z); Fotogrammi (t): numero di immagini suddivise per numero di canali; Modalità di visualizzazione: Scala di grigi.
      nota: Vengono generate due sequenze di immagini separate, corrispondenti ai due diversi canali.

Figura 1. Rappresentazione schematica del "Phagosome closure assay" analizzato mediante TIRFM. Il saggio di chiusura dei fagosomi viene eseguito utilizzando macrofagi che esprimono transitoriamente una o due proteine marcate in fluorescenza. I macrofagi vengono depositati su SRBC opsonizzati con IgG fissati in modo non covalente su vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina. Le immagini vengono registrate in modalità TIRF per rilevare il sito di chiusura del fagosoma e in modalità epifluorescenza per rilevare la base della coppa fagocitica.

Figura 2: Determinazione dell'angolo critico per TIRFM. (A) Utilizzando l'"acquisizione dal vivo", una cellula che esprime proteine marcate in fluorescenza viene posta al centro del campo (regione 1 in rosso). Con l'opzione TIRF Stack, le immagini sono state acquisite a una lunghezza d'onda di eccitazione, con angoli diversi a partire da 0° fino a 5°, con un incremento di 0,01° (regione 2 in rosso). (B) La sequenza di immagini viene aperta utilizzando il software ImageJ Color Profiler e l'intensità media di fluorescenza di una regione di interesse (ROI) viene tracciata in funzione degli angoli sull'asse x utilizzando "Stacks" e "PlotZ axis profile" (regione 1 in rosso). (C) La posizione x del picco di fluorescenza sul grafico corrisponde all'angolo critico: 1,98° (linea tratteggiata nera). È possibile utilizzare qualsiasi valore dopo questo angolo. Ad esempio, è possibile scegliere 2,00° (linea rossa).

Figura 3. Processo del flusso di lavoro utilizzando il modulo di acquisizione in tempo reale: "Editor di protocollo". (A) Nella finestra "Editor protocollo", viene creata un'area di disegno del flusso di lavoro. (B) Questo protocollo comprende un "Loop" di azioni che il microscopio ripeterà il numero di volte deciso dall'utente. Ad esempio: 750 (1). Un loop includeva: acquisizione "Multi Channels" con eccitazione laser di proteine fluorescenti di interesse in modalità TIRF. Ad esempio: Laser 491 nm intensità 50% -Angolo TIRF 2,00 (2); "Spostamento Z" dell'obiettivo 3 μm (3); Acquisizione "Multi Canali" in modalità epifluorescenza (4); "Spostamento Z" dell'obiettivo verso la regione TIRF (5) e "Istantanea" in luce trasmessa (6).