Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento a gradiente di densità delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC)
- Aggiungere 25 ml di sangue intero eparinizzato in una provetta da 50 ml con una pipetta da 25 ml.
- Diluire le cellule con 25 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 15 ml di gradiente di densità Ficoll-Paque in una nuova provetta da 50 ml e, inclinando la provetta, aggiungere molto lentamente e con attenzione 25 ml della sospensione cellulare diluita sul gradiente di densità in modo che non vi sia miscelazione di tutto il sangue con il gradiente di densità, cioè nessun disturbo dell'interfaccia del gradiente di densità del sangue.
- Centrifugare la sospensione dal passaggio 1.2 a 400 × g per 30-40 minuti in un rotore a benna oscillante a temperatura controllata senza freno a 20 °C.
nota: Dopo la centrifugazione dovrebbero essere evidenti tre strati distinti: lo strato superiore è il plasma; lo strato inferiore chiaro è il gradiente di densità di Ficoll-Paque; e un sottile strato cellulare intermedio sono le PBMC.
- Aspirare e scartare lo strato superiore mediante aspirazione con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare lo strato interfasico delle cellule mononucleate (cioè linfociti, monociti e piastrine).
- Raccogliere con cura questo strato di cellule mononucleate con una pipetta da 10 ml in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml.
- Riempire la provetta con 20 ml di PBS, mescolare bene e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 20°C. Rimuovere completamente il surnatante dopo la centrifugazione.
- Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di PBS e centrifugare a 200 × g per 10-15 minuti a 20 °C. Rimuovere completamente il surnatante dopo la centrifugazione.
nota: Questo passaggio rimuove le piastrine, che sono indesiderate, all'interno delle PBMC; Questo passaggio può essere ripetuto per garantire la completa rimozione delle piastrine.
- Se non si desidera selezionare popolazioni specifiche, risospendere il pellet cellulare in un terreno completo leucocitario (10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di L-glutammina e 1% di penicillina/streptomicina in terreno RPMI-1640) per la coltura dopo aver eseguito una conta cellulare per sospendere 1 ml di terreno per 10-7 PBMC prima di procedere alla fase successiva.
2. Marcatura Magnetica delle Popolazioni di Leucociti
- Centrifugare la sospensione di PBMC a 300 × g per 10 minuti e aspirare completamente il surnatante.
- Pellet di risospensione in 80 μl di PBS per 107 celle totali.
- Aggiungere 20 μl di microsfere magnetiche specificate (ad esempio, biglie magnetiche CD14 per l'isolamento dei monociti, biglie magnetiche CD4 per l'isolamento dei linfociti T) per 107 cellule totali.
- Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 2-8 °C in frigorifero.
- Aggiungere 1-2 ml di PBS per 107 cellule da lavare e centrifugare a 300 × g per 10 min.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere fino a 10-8 cellule in 500 μl di PBS.
3. Selezione magnetica delle sottopopolazioni di leucociti
Nota: Sono disponibili una varietà di separatori di microsfere magnetiche e colonne per l'isolamento di una popolazione specifica di leucociti mediante marcatore di superficie cellulare da un certo numero di produttori. L'isolamento può avvenire per selezione positiva basata su uno o pochi marcatori positivi o per selezione negativa dopo l'esaurimento di popolazioni indesiderate. Di seguito viene descritto un approccio generale per eseguire la selezione positiva utilizzando un marcatore (ad esempio, CD4 per i linfociti T helper o CD14 per i monociti).
- Preparare e adescare il separatore magnetico comprensivo di colonna di separazione secondo le istruzioni del produttore.
- Applicare la provetta contenente il campione di PBMC etichettati. Fornire due provette da centrifuga da 15 ml per la raccolta delle frazioni cellulari etichettate positivamente e non etichettate, seguendo le istruzioni del produttore.
- Contare il numero di cellule e risospendere i leucociti selezionati positivamente (cioè linfociti T CD4+ o cellule CD14+) nel terreno completo leucocitario, utilizzando 1 ml di terreno per 10-7 cellule.
4. Carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) Colorazione dei leucociti per la valutazione della proliferazione
Nota: la CFSE è stata ampiamente utilizzata nelle indagini immunologiche, sia per gli studi in vivo che in vitro. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per lo studio in vitro delle interazioni MSC/PBMC (o altri leucociti). Sebbene le fasi generali coinvolte nella conduzione della marcatura in vitro della CFSE siano simili, potrebbero esserci differenze nella dose specifica e nella tempistica del protocollo. Ciò può essere dovuto a una serie di fattori, ad esempio il tipo di cella specifico utilizzato, il numero di cellule utilizzate, che possono probabilmente influenzare l'intensità del segnale fluorescente CFSE.
- Diluire la soluzione madre di CFSE (10 mM) in PBS alla concentrazione di lavoro desiderata di 10 μM (soluzione di lavoro CFSE). Preparare 10-7 celle (cioè PBMC o cellule T) per la marcatura con la soluzione di lavoro CFSE.
- Centrifugare a 300 × g per 10 minuti per ottenere un pellet cellulare e aspirare il surnatante.
- Risospendere delicatamente le cellule in 1 ml di soluzione preriscaldata (37 °C) di CFSE e incubare le cellule per 10 minuti a 37 °C.
- Per eliminare l'eccesso di CFSE, diluire la sospensione cellulare con 10 volte (in volume) di terreno RPMI preraffreddato (4 °C) contenente il 10% di FBS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet della cella in questo modo altre due volte.
- Ripellettare le celle mediante centrifugazione e contare il numero di cellule. Risospendere 107 cellule (PBMC o cellule T) in 1 ml di terreno completo di leucocitaria fresco e preriscaldato.
5. Saggio di soppressione effettrice Leucociti immunomodulatori selezionati da microsfere magnetiche, indotte da MSC su cellule CD4 + T effettrici attivate marcate con CFSE
- Seminare MSC a 250.000 cellule in 3 ml di terreno completo di MSC in piastre a 6 pozzetti (densità MSC: 25.000 cellule/cm2) per l'attacco O/N in un incubatore a 37 °C, consentendo alle cellule staminali di raggiungere l'80% di confluenza. Sono necessarie almeno 3 piastre a 6 pozzetti per garantire un numero sufficiente di PBMC cocoltivate con MSC per la selezione delle sottopopolazioni.
- Aspirare il terreno e aggiungere le PBMC separate come indicato nella fase 1 ma in piastre a 6 pozzetti a 2,5 x 106 cellule/pozzetto (densità cellulare: 250.000 leucociti/cm2) con 3 ml di terreno completo leucocitario. Co-coltura per 48-72 ore in un'incubatrice a 37 °C.
- Popolazione specifica di leucociti immunomodulatori indotti da MSC (cioè cellule CD14+) secondo le Sezioni 2-3.
nota: A questo punto può essere eseguita la colorazione intracellulare delle citochine per l'analisi citofluorimetrica per valutare i cambiamenti nel profilo di espressione delle citochine leucocitarie, cioè l'espressione dell'interleuchina-10-as modulata dalle MSC.
- Aggiungere le cellule T CD4+ allogeniche marcate con CFSE generate secondo le sezioni 2-4 in piastre a 24 pozzetti in 1 ml di terreno completo leucocitario (densità delle cellule T: 250.000 cellule/cm2) a leucociti indotti da MSC selezionati con perline in vari rapporti, ovvero rapporti 1:10, 1:5, 1:2 e 1:1 (cellula-cellula).
- Per stimolare le cellule T CD4+, aggiungere microsfere coniugate α-CD3/28 per ottenere un rapporto perlina-cellula di 1:1.
- Per un controllo negativo, piastra 500.000 cellule T CD4+/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (densità delle cellule T: 250.000 cellule/cm2) con solo 1 ml di terreno completo leucocitario; per il controllo positivo, oltre a placcare lo stesso numero di cellule T CD4+/pozzetto, aggiungere microsfere coniugate α-CD3/28 per ottenere un rapporto perlina-cellula di 1:1.
- Il 3° giorno di co-coltura, valutare la proliferazione delle cellule T CD4+ marcate con CFSE (poste in provette a fondo tondo) mediante analisi citofluorimetrica con filtri di eccitazione ed emissione a 488 nm appropriati per la fluoresceina.