Un'indagine sul flusso in vitro dell'effetto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti

Abstract

Fonte: Munir, H. et al., Analisi degli effetti delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti dal flusso. (2015)

Il video dimostra un metodo per studiare l'impatto delle cellule stromali sul reclutamento dei leucociti. In un modello di camera a flusso a piastre parallele, le citochine pro-infiammatorie inducono l'espressione di recettori di adesione da parte delle cellule endoteliali, facilitando il reclutamento e la migrazione dei neutrofili. Il cross-talk tra le cellule stromali e le cellule endoteliali diminuisce il reclutamento dei neutrofili nelle cellule endoteliali.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Isolamento e coltura di cellule endoteliali umane primarie e cellule staminali mesenchimali

1. Isolamento e coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC):
   1. Metti il cordone ombelicale su un vassoio con carta assorbente e spruzzalo con etanolo al 70%. Collocare in una cappa di coltura tissutale. Identificare la vena e incannulare ad entrambe le estremità. Posizionare una fascetta attorno all'estremità cannulata per fissarla.
   2. Lavare il sangue venoso con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzando una siringa. Riempire la siringa con aria e passare attraverso la vena per rimuovere e scartare il PBS residuo.
   3. Scongelare 10 mg/ml di collagenasi di tipo Ia e diluire 1:10 in PBS (con cloruro di calcio e magnesio) fino a una concentrazione finale di 1 mg/ml. Passare la soluzione di collagenasi nella vena fino a riempire entrambe le cannule. Chiudere i morsetti sulle cannule ad entrambe le estremità.
   4. Coprire la vaschetta con un fazzoletto di carta e spruzzare con etanolo al 70%. Mettere il cavo in un'incubatrice per 20 minuti a 37 °C e 5% di anidride carbonica (CO_{2 ).}
   5. Estrarre il cavo dall'incubatrice e stringere le fascette. Massaggiare delicatamente il cordone per 1 minuto. Sciacquare la sospensione cellulare con 10 ml di PBS e raccoglierla in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   6. Riempire la siringa con aria e passare attraverso la vena per rimuovere l'eventuale PBS residuo due volte, raccogliendo il PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzata al punto 1.1.5. Centrifugare a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
   7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno completo di cellule endoteliali (EC). Il terreno EC è costituito da M199 integrato con 35 μg/ml di gentamicina solfato, 10 ng/ml di fattore di crescita epidermico umano, 1 μg/ml di idrocortisone, 2,5 μg/ml di amfotericina B e il 20% di siero fetale di vitello.
   8. Aggiungere 4 ml di terreno EC e la sospensione EC in un matraccio da 25 cm². Cambiare il mezzo il giorno successivo e poi ogni 2 giorni.
   9. Le EC mostrano una morfologia simile a quella dei ciottoli (Figura 1Ai). Per i saggi di adesione, le EC vengono generalmente seminate quando raggiungono il 100% di confluenza (vedere la Sezione 1.4).
2. Isolamento delle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJMSC) dal cordone ombelicale umano:
   1. Isolare le MSC derivate dalla gelatina di Wharton (WJMSC) da cordoni ombelicali freschi o da cordoni che sono già stati utilizzati per isolare l'EC. Tagliare il cordone ombelicale in pezzi lunghi 5 cm. Tagliare ogni pezzo longitudinalmente per rivelare i vasi sanguigni (2 arterie [bianche, rigide] e 1 vena [gialla, distesa]).
   2. Usando forbici e pinze sterili, rimuovere i vasi sanguigni e scartarli. Tagliare tutto il fazzoletto in 2 - 3 mm³ pezzi. Usando una pinza, inserire² - 3 pezzi da 3 mm in una provetta da centrifuga da 50 ml.
   3. Scongelare 100 mg/ml di collagenasi madre di tipo II e diluire 1:100 in 10 ml di PBS a una concentrazione finale di 1 mg/ml. Scongelare 20.000 U/ml di ialuronidasi stock e diluire 1:400 a una concentrazione finale di 50 U/ml nella soluzione di collagenasi.
   4. Aggiungere un cocktail enzimatico alla provetta da centrifuga contenente i frammenti di tessuto. Incubare i frammenti di tessuto per 5 ore a 37 °C su un rotatore lento.
   5. Diluire la sospensione cellulare 1:5 in PBS. Inserire un filtro per pori da 100 μm in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Versare la sospensione cellulare sul filtro poroso da 100 μm.
      nota: I frammenti di tessuto rimanenti verranno trattenuti sul filtro e le cellule verranno raccolte nella provetta da centrifuga da 50 ml.
   6. Eliminare il filtro. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 10 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet WJMSC in 12 ml di terreno di coltura WJMSC completo (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM a basso glucosio, 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 100 U/ml di penicillina + 100 μg/ml di miscela di streptomicina).
   7. Seminare tutte le cellule in un pallone di coltura tissutale da 75 cm². Cambiare il terreno dopo 24 ore con 12 ml di terreno di coltura WJMSC completo. Sostituire il fluido ogni 2 - 3 giorni. Le cellule dovrebbero raggiungere il 70-80% di confluenza entro 2 settimane. Passaggio quando WJMSC raggiunge il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4).
3. Espansione delle MSC derivate dal midollo osseo (BMMSC):
   1. Isolare le MSC derivate dal midollo osseo umano (BMMSC) come descritto in precedenza. Aggiungere 10 ml di cellule staminali mesenchimali preriscaldate, terreno di crescita MSC (MSCGM) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   2. Scongelare un flaconcino di p2 BMMSC mettendolo in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere la sospensione di BMMSC alla provetta da centrifuga contenente MSCGM. Mescolare bene pipettando.
   3. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a RT. Aspirare completamente il surnatante.
   4. Risospendere le cellule in 1 ml di MSCGM e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule digitale come un cellometro.
   5. Seminare le cellule in fiasche di coltura da 75 cm² a una densità di 5.000 - 6.000 cellule per cm² in 12 ml di MSCGM. Cambiare il terreno dopo 24 ore con 12 ml di MSCGM. Alimentare le cellule con 12 ml di MSCGM ogni 2 - 3 giorni.
   6. Passaggio quando BMMSC raggiunge il 70 - 80% di confluenza (vedi Sezione 1.4). Le cellule presentano una morfologia fibroblastica (Figura 1Aii).
4. Distaccamento di EC e MSC:
   1. Aspirare il terreno da 25 cm² matracci di coltura. Aggiungere 2 ml di acido etilendiamminotetraacetico allo 0,02% (EDTA) per circa 2 minuti. Aspirare l'EDTA e aggiungere 2 ml di tripsina (2,5 mg/ml). Osserva al microscopio fino a quando le cellule diventano rotonde.
   2. Tocca il pallone per staccare le celle. Inattivare la tripsina aggiungendo 8 ml di terreno di coltura (a seconda del tipo di cellula; EC per HUVEC, DMEM LG per WJMSC e MSCGM per BMMSC) al pallone di coltura e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   3. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet come descritto di seguito.
      1. Per il passaggio di MSC, risospendere il pellet in un terreno di coltura da 3 ml. Aggiungere 11 ml di terreno di coltura in tre palloni di coltura separati da 75 cm². Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare a ciascun pallone di coltura (divisione 1:3). Passaggio WJMSC e BMMSC 3 volte (p3) prima dell'uso in saggi di co-coltura.
      2. Per la semina di EC o MSC in saggi di adesione – vedere le sezioni 2 e 3.
5. Congelamento di MSC:
   1. Al passaggio 3 staccare MSC come descritto nella Sezione 1.4. Aspirare il surnatante e risospendere in 3 ml di CryoSFM ghiacciato. Pipettare 1 ml di aliquote di sospensione cellulare in 1,5 ml di crioviali ghiacciati. Metti i crioviali in un contenitore per il congelamento.
   2. Conservare il contenitore a -80 °C o/n. Trasferire in azoto liquido. Scongelare una fiala di MSC (seguire i passaggi 1.3.1 - 1.3.6). Risospendere l'MSC in un terreno di coltura da 5 ml (scegliere il terreno appropriato per WJMSC o BMMSC) e seminare in un matraccio da 25 cm².

2. Stabilire co-colture di cellule staminali endoteliali-mesenchimali su filtri

1. Scollegare WJ o BMMSC come descritto nella Sezione 1.4. Risospendere il pellet in 1 ml di MSCGM. Eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un cellometro.
2. Regolare il volume in modo che la concentrazione finale sia 5 x 10⁵ MSC in 500 μl di MSCGM.
3. Utilizzando una pinza sterile, capovolgere i filtri Transwell in PET da 0,4 μm a 6 pozzetti e metterli in una scatola sterile.
4. Seminare 5 x 10⁵ MSC sulla superficie esterna dei filtri. Incubare i filtri a 37 °C e 5% di CO₂ per 1 ora.
5. Raccogliere i media dalla superficie esterna del filtro. Conta il numero di MSC non aderenti nei media. Invertire nuovamente i filtri utilizzando una pinza sterile e posizionarli in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 ml di MSCGM.
6. Aggiungere 2 ml di MSCGM sulla superficie interna del filtro (Figura 1B). Porre in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore. Tripsinizzare un pallone confluente di 25 cm² di EC (Figura 1Ai; come Sezione 1.4).
7. Risospendere l'EC in 8 ml di MSCGM (1 fiasco da^{25 cm 2} seminerà quattro filtri a 6 pozzetti; ~5 x 10⁵ EC/filtro). Aspirare il terreno dalla parte superiore e inferiore dei filtri porosi. Aggiungere 3 ml di MSCGM fresco nella camera inferiore (sotto il filtro). Aggiungere 2 ml di sospensione EC sulla superficie interna di ciascun filtro. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO₂.
8. Aspirare il terreno per lavare via l'EC non aderente e sostituirlo con MSCGM fresco. Impostare filtri di monocoltura EC paralleli seminando le cellule sulla superficie interna senza prima seminare le MSC. Incubare O/N a 37 °C e 5% CO₂.
9. Verificare che il monostrato EC sia confluente e non contenga spazi vuoti. I monostrati sub-confluenti non possono essere utilizzati per i saggi di adesione (Figura 1B).
10. Scongelare 1 x 10⁵ U/ml di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα) e diluire 1:1.000 in MSCGM a una concentrazione finale di 100 U/ml (equivalente a ~10 ng/ml). Eseguire una diluizione seriale diluendo 100 U/ml di TNFα per 1:10 in MSCGM per ottenere 10 U/ml. Diluire 10 U/ml di TNFα 1:10 in MSCGM per ottenere 1 U/ml.
11. Trattare le camere superiore e inferiore dei filtri con 1, 10 o 100 U/ml di TNFα (equivalente a ~10 ng/ml) a 37 °C per 4 ore prima del saggio.

3. Isolamento dei leucociti

1. Prelevare il sangue venoso da volontari sani e aliquotare immediatamente in provette EDTA. Capovolgere delicatamente i tubi per mescolare.
2. Sovrapporre 2,5 ml di Histopaque 1077 su 2,5 ml di Histopaque 1119 in un tubo da 10 ml a fondo tondo. Sovrapporre 5 ml di sangue intero sul gradiente Histopaque. Centrifugare a 800 x g per 40 min a RT.
3. Raccogliere neutrofili polimorfonucleati periferici (PMN) all'interfaccia di Histopaque 1077 e 1119 (sopra lo strato eritrocitario). Mettere in un tubo a fondo tondo da 10 ml e truccare a 10 ml con PBSA. Capovolgere delicatamente la provetta e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a RT.
4. Diluire la soluzione BSA al 7,5% 1:50 in 100 ml di PBS (con cloruro di calcio e magnesio) ad una concentrazione finale dello 0,15% (p/v; PBSA). Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml di PBSA. Centrifugare a 400 x g per 5 min a RT.
5. Risospendere in 1 ml di PBSA. Prelevare 20 μl di aliquota della sospensione cellulare e aggiungerla a 380 μl di PBSA (diluizione 1:20). Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un cellometro. Diluire alla concentrazione richiesta (1 x 10⁶/ml per filtri Transwell e microvetrini Ibidi) in PBSA. Mantenere la sospensione di neutrofili a RT fino al test.

4. Assemblaggio del sistema di flusso

1. Impostare il sistema di flusso come mostrato nella Figura 1C. Accendere il riscaldatore e impostare a 37 °C. Collegare una siringa da 20 ml (rimuovere lo stantuffo) e una siringa da 5 ml a un rubinetto a 3 vie. Fissare il rubinetto alla camera in perspex utilizzando del nastro Micropore.
2. Misurare e tagliare un lungo pezzo di tubo in silicone da 2/4 mm (spesso) che sia approssimativamente alla distanza tra la valvola e il rubinetto a 3 vie. Tagliare un pezzo di tubo lungo 8 - 10 mm di 1/3 mm (sottile) e inserirlo in un'estremità del tubo spesso. Fissare il lato del tubo spesso al rubinetto a 3 vie.
3. Collegare l'estremità del tubo sottile a una porta della microvalvola elettronica a 3 vie. Questo è il "serbatoio di lavaggio". Tagliare un pezzo di tubo spesso e sottile lungo 6 - 8 mm.
4. Inserire il tubo sottile in un'estremità del tubo spesso. Collegare l'estremità spessa del tubo a una siringa da 2 ml (rimuovere lo stantuffo).
5. Collegare l'estremità sottile del tubo della siringa da 2 ml a una porta sulla microvalvola elettronica per creare il "serbatoio del campione". Collegare la valvola alla camera di flusso del filtro misurando e tagliando un lungo pezzo di tubo sottile, ovvero la distanza tra la microvalvola e il centro del tavolino del microscopio.
6. Per il modello a microscorrimento, collegare un pezzo di tubo spesso 8 - 10 mm all'estremità del tubo sottile. Posizionare un connettore a forma di L all'estremità del tubo spesso. Questo si collegherà alla microvetrina. Per il modello con filtro, collegare un pezzo di manometro Portex Blue Line da 8 - 10 mm che collega il tubo all'estremità del tubo sottile.
7. Posizionare l'estremità sottile del tubo sulla microvalvola. Questa è l'uscita comune per i serbatoi di lavaggio e di campionamento. Riempi i serbatoi con PBSA. Adescare i tubi facendo scorrere PBSA attraverso di essi per rimuovere eventuali bolle d'aria.
8. Collegare il tubo del manometro a una siringa di vetro da 29 mm (50 ml). Adescare la siringa riempiendola con 10 ml di PBSA. Capovolgere la siringa in modo che l'estremità collegata al tubo sia rivolta verso l'alto e spingere fuori tutte le bolle d'aria. Ricarica con 5 ml di PBSA.
9. Solo per il modello a microvetrino, collegare un pezzo di tubo spesso 10 - 12 mm all'estremità del tubo del manometro che porta alla siringa di vetro. Posizionare un connettore a forma di L all'estremità del tubo spesso. Inserire la siringa di vetro in una pompa a siringa per l'infusione/l'estrazione.
10. Calcolare la portata di riempimento (Q) necessaria per generare la sollecitazione di taglio della parete desiderata (τ_w in Pascal, Pa) di 0,1 Pa (filtri Transwell) o 0,05 Pa (microvetrini Ibidi) utilizzando le seguenti formule:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Dove w = larghezza interna e h = profondità interna del canale di flusso. n = viscosità della soluzione che scorre; PBSA è n = 0,7 mPa.s. Per la camera di flusso del filtro a piastre parallele, la larghezza (l) è di 4 mm e la profondità (h) è di 0,133 mm. La profondità della camera può variare leggermente a causa delle differenze nello spessore della guarnizione Parafilm utilizzata. Per la microslitta Ibidi, la larghezza è di 3,8 mm e la profondità è di 0,4 mm.
    nota: A causa delle differenze nelle dimensioni del canale di flusso e nella dinamica di cattura, utilizziamo sollecitazioni di taglio diverse per il modello a microscivolo rispetto al modello a filtro.

5. Impostazione della camera di flusso a piastre parallele che incorpora filtri

1. Tagliare un pezzo di Parafilm (della stessa dimensione del vetrino coprioggetti) utilizzando una dima metallica. Ritagliare una fessura di 20 x 4 mm nel Parafilm (per creare il canale di flusso) utilizzando una sagoma metallica. Utilizzare la guarnizione per contrassegnare il canale di flusso sul vetrino coprioggetti.
2. Allineare i bordi del filtro a 6 pozzetti sul vetrino coprioggetti. Assicurarsi che il filtro copra i contrassegni del canale di flusso. Ritagliare con cura il filtro utilizzando un bisturi di tipo 10A.
3. Coprire accuratamente il filtro con una guarnizione Parafilm, assicurandosi che la fessura del canale di flusso si trovi al centro del filtro (Figura 1D). Usa un pezzo di fazzoletto pulito e spingi fuori eventuali bolle.
4. Posizionare il vetrino coprioggetti nell'incavo della piastra inferiore della camera di flusso in perspex. Posizionare la piastra superiore in perspex sopra la guarnizione e avvitare insieme le piastre (Figura 1D).
5. Ruotare il rubinetto a 3 vie per consentire al tampone di lavaggio (PBSA) di fluire attraverso la valvola. Collegare il tubo del manometro alla porta di ingresso della piastra superiore in perspex. Far passare PBSA attraverso il canale di flusso per consentire il passaggio delle bolle.
6. Collegare il tubo del manometro dalla pompa a siringa alla porta di uscita della piastra in perspex. Impostare la pompa a siringa in modo che si riempia e premere RUN. Pulire l'eventuale PBSA che è gocciolato sulla piastra superiore della camera.
7. Posizionare la camera sul tavolino di un microscopio a contrasto di fase invertito. Regolare la messa a fuoco per visualizzare l'EC sopra i filtri (Figura 1B).

6. Perfusione di leucociti su cellule endoteliali

1. Mettere 2 ml di neutrofili purificati nel serbatoio del campione e lasciare riscaldare per 2 minuti. Lavare l'endotelio con PBSA per 2 minuti.
2. Accendere la valvola per perfondere i neutrofili sull'endotelio. Erogare il bolo di neutrofili per 4 minuti. Chiudere la valvola e perfondere PBSA dal serbatoio di lavaggio per il resto dell'esperimento.
3. Assicurarsi che le bolle d'aria non passino attraverso il canale di flusso in nessun punto durante il test, in quanto ciò interromperebbe il monostrato EC e causerebbe il distacco dei neutrofili aderenti.

7. Registrazione della cattura e del comportamento dei neutrofili

1. Registrare il reclutamento dei neutrofili durante il flusso dei neutrofili o dopo la perfusione.
2. Effettuare tutte le registrazioni digitali di almeno 5 - 10 campi al centro del canale di flusso. Identificare il centro del canale spostando l'obiettivo sul bordo del canale in corrispondenza della porta di ingresso e identificando il centro della porta.
   1. Per la registrazione durante il flusso di neutrofili, scattare immagini di un singolo campo ogni 10 secondi per 1 minuto. Spostarsi lungo il canale e registrare un altro campo per 1 minuto. Ripetere per tutta la durata del bolo.
   2. Per la registrazione della post-perfusione, effettuare registrazioni di 10 secondi di 5-10 campi al centro del canale di flusso per valutare il comportamento dei leucociti (in genere 2 minuti dopo la fine del bolo dei neutrofili). Scatta immagini ogni secondo entro l'intervallo di 10 secondi. Ciò consente di analizzare il tempo sufficiente per la cattura dal flusso e il comportamento dei neutrofili aderenti.
   3. Registrare un singolo campo contenente almeno 10 neutrofili trasmigrati per 5 minuti, scattando immagini ogni 30 secondi. Questo può essere utilizzato per calcolare la velocità delle cellule migrate (sopra o sotto l'endotelio).
   4. Registrare un'altra serie di campi di 10 secondi (in genere 9 minuti dopo la perfusione). Ciò consente ai neutrofili di migrare attraverso il monostrato endoteliale.
   5. Arrestare la pompa a siringa e rimuovere il tubo. Smontare la camera di flusso e sciacquare il serbatoio del campione e il tubo. Ripetere l'operazione per i filtri/canali microslide successivi.

8. Analisi del reclutamento e del comportamento dei leucociti

1. Contare il numero di neutrofili in ciascun campo durante le registrazioni di 10 secondi al punto temporale di 2 minuti. Tutte le celle devono essere presenti nel campo primo-secondo per poter essere conteggiate. Le celle che si trovano parzialmente nel campo su 2 lati (ad esempio, il bordo superiore/destro) del campo visivo sono incluse nei conteggi, purché rimangano nel campo per tutti i 10 secondi.
2. Calcola il numero medio di neutrofili aderenti per campo. Misurare la lunghezza e la larghezza del campo registrato. Calcola l'area del campo. Calcola quanti campi ci sono in 1 mm². Moltiplicare la conta media dei neutrofili per il numero di campi in 1 mm².
3. Calcolare il numero totale di neutrofili perfusi moltiplicando la quantità di neutrofili perfusi (ad esempio, 2 x 10⁶/ml*Q [ad esempio, 0,0999 ml/min per la camera a flusso a piastre parallele]) per la durata del bolo (ad esempio, 4 min).
4. Dividere la conta dei neutrofili/mm² per il numero totale di neutrofili perfusi per determinare il numero totale di cellule che hanno aderito (cellule aderenti/mm² / 10⁶ perfuse).
5. Valutare se i neutrofili aderenti sono rotolanti, saldamente aderenti o trasmigrati.
   1. Un neutrofilo rotante è in fase brillante e si muoverà lentamente lungo il monostrato endoteliale (1 - 10 μm/sec).
   2. Le cellule saldamente aderenti sono in fase brillante e legate alla superficie dell'EC, rimanendo stazionarie (cioè non muovendosi durante la registrazione) o hanno subito un cambiamento di forma e stanno migrando sulla superficie dell'EC (Figura 1Ei).
   3. Un neutrofilo trasmigrato è in fase scura e al di sotto dello strato EC (Figura 1Eii).
6. Calcola la percentuale di cellule aderenti che rotolano, stazionarie e trasmigrate. In alternativa, il comportamento dei neutrofili può essere espresso come numero totale di cellule che mostrano i diversi comportamenti applicando la stessa formula utilizzata per calcolare l'adesione totale (come descritto nei passaggi 8.6 - 8.7).
   1. Segna il bordo anteriore di un neutrofilo rotolante. Contrassegnare il bordo iniziale della stessa cella alla fine della sequenza di 10 secondi. Disegna una linea tra i 2 punti e misura la distanza percorsa dalla cella.
   2. Dividi questo valore per la durata della registrazione in cui la cella sta rotolando (cioè 10 sec). Prova a selezionare i neutrofili che si trovano sul campo per l'intero intervallo di 10 secondi.
7. Per calcolare la velocità di migrazione dei neutrofili sulla superficie (forma modificata fase chiara) o sotto l'endotelio (fase scura) utilizzare la registrazione di 5 minuti.
   1. Disegna un contorno delle cellule migrate all'inizio della sequenza e traccia i loro movimenti durante la sequenza. Prendere nota delle posizioni X e Y del baricentro ad ogni intervallo di 1 minuto per ogni cella. Sottrarre i valori delle posizioni X e Y dalla prima immagine della sequenza dai valori della seconda immagine. Questo si basa sul teorema di Pitagora.
   2. Sottrarre i valori dalla seconda immagine dalla terza immagine. Eseguire questa operazione per tutte le immagini della sequenza. Eleva al quadrato i valori X e Y e sommali.
   3. Radice quadrata il valore risultante. Calcola la velocità per ogni cella facendo la media delle velocità calcolate ad ogni intervallo di minuti. Traccia 10 neutrofili migrati e calcola la velocità media.

Risultati

Figura 1. Definizione della co-coltura EC-MSC e analisi del reclutamento dei neutrofili utilizzando un saggio di adesione basato sul flusso. (A) Micrografia di (i) EC primaria e (ii) BMMSC di passaggio 3 coltivate su fiasche di coltura tissutale. (B) Micrografia di EC e MSC coltivate su inserti filtranti Transwell a 6 pozzetti. (C) D...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagenasi di tipo Ia	sigma	C2674	Diluire in 10 ml di PBS per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/ml. Conservare a -20°C in aliquote da 1 ml.
La PBS di Dulbecco	sigma	D8662	Con cloruro di calcio e magnesio. Conservare sterile e conservare a temperatura ambiente.
1X Medio M199	Gibco	Codice 31150-022	Scaldare a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
Gentamicina solfato	sigma	G1397	Conservare a 4°C. Aggiungere al flacone M199 da 500 ml.
Fattore di crescita epidermico umano	sigma	E9644	Conservare a -20°C in aliquote da 10μl.
Siero fetale di vitello (FCS)	sigma	F9665	FCS deve essere testato in batch per garantire la crescita e la vitalità dell'EC isolata. Inattivare a calore a 56°C. Conservare in aliquote da 10 ml a -20°C.
Amfotericina B	Gibco	Codice 15290-026	Potente e diventa tossico entro una settimana, quindi il terreno HUVEC completo e fresco deve essere preparato ogni settimana. Conservare a -20°C in aliquote da 1 ml.
idrocortisone	sigma	H0135	Lo stock è in etanolo. Conservare a -20°C in aliquote da 10μl.
Collagenasi di tipo II	sigma	Codice: C6885	Diluire il brodo in PBS fino a una concentrazione finale di 100 mg/ml. Conservare a -20°C in aliquote da 100 μl.
ialuronidasi	sigma	H3631	Diluire il brodo in PBS a una concentrazione finale di 20.000 U/ml. Conservare a -20°C in aliquote da 100 μl.
Filtro cellulare da 100μm per provetta centifuga da 50 ml	Forniture di laboratorio scientifiche (SLS)	Codice 352360	Possono essere utilizzati anche altri filtri cellulari disponibili in commercio (ad es. Greiner bio-one).
DMEM a basso contenuto di glucosio	Biosieri	Pannello LM-D1102/500	Scaldare a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
Miscela di penicillina/streptomicina	sigma	P4333	Conservare a -20°C in aliquote da 1 ml.
Pallone per coltura tissutale da 25 cm2	Sls	353109
Pallone per coltura tissutale da 75 cm2	Sls	353136
Fiala di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo	Lonza	PT-2501	Conservare in azoto liquido all'arrivo. Le celle si trovano al passaggio 2 all'arrivo, ma sono designate come passaggio 0. Passare al passaggio 3 e conservare in azoto liquido per un uso successivo.
Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Scaldare a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso. Per la colorazione verde Cell Tracker utilizzare un mezzo senza FCS.
Soluzione EDTA (0,02%)	sigma	E8008	Conservare a 4°C. Scaldare a bagnomaria a 37°C prima dell'uso.
Soluzione di tripsina	sigma	T4424	Conservare a -20°C in aliquote da 2ml. Scongelare a temperatura ambiente e utilizzare immediatamente.
Criovali	Greiner bio-one	Anno 2019-02	Tenere in ghiaccio prima di aggiungere prima di aggiungere la sospensione cellulare.
Mr. Frosty Contenitore di congelamento	Nalgene	Codice: 5100-0001	Conservare a temperatura ambiente. Quando si aggiungono crioviali con cellule, conservare a -80°C per 24 ore prima di trasformare le cellule in azoto liquido.
Colorante verde per inseguitore di celle	Tecnologie di vita	C2925	Conservare in aliquote da 5μl a -20°C. Diluire in 5ml di MSCGM preriscaldato (a 37°C).
Camere di conteggio delle cellule	Nexcelom	SD-100	In alternativa è possibile utilizzare un emocitometro.
Cellometro contatore automatico di celle T4	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Fattore di necrosi tumorale α (TNFα)	Sistemi di ricerca e sviluppo	210-TA-100	Diluire il brodo in PBS a una concentrazione finale di 100.000 U/ml. Conservare a -80°C in aliquote da 10 μl.
Filtri Transwell in PET a 6 pozzetti, 0,4 μm	Sls	Codice 353090
K2-EDTA in tubi da 10 ml	Sarstedt		Conservare a temperatura ambiente.
Histopaque 1119	sigma	Codice: 11191	Conservare a 4°C. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Histopaque 1077	sigma	Codice 10771	Conservare a 4°C. Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
Tubo a fondo tondo da 10 ml	Boschi di Appleton	SC211 142 COME
Soluzione BSA frazione V al 7,5%	Tecnologie di vita	Codice 15260-037	Conservare a 4°C.
Siringhe Plastipak da 20 ml	Falco BD	300613
Siringhe Plastipak da 5 ml	Falco BD	302187
Siringhe Plastipak da 2 ml	Falco BD	300185
Nastro chirurgico ipoallergenico 3M 9m x 2,5 cm	Micropori	Anno 1530-1	Utilizzare per fissare il rubinetto della siringa sulla parete della camera in perspex.
Tubo in gomma siliconica, diametro interno/diametro esterno (ID/OD) di 1/3 mm (tubo sottile)	Fisher Scientifico	FB68854	Tagliare il tubo in silicone alla dimensione appropriata. Tutti i tubi che portano direttamente alla microvalvola elettronica devono essere sottili.
Tubo in gomma siliconica ID/OD di 2/4 mm (tubo spesso)	Fisher Scientifico	FB68855
Tubo manometro Portex Blue Line	Smiths	200/495/200	Tubo che porta alla pompa a siringa.
Rubinetto a 3 vie	BOC Ohmeda AB
Siringa in vetro da 50 ml per pompa	Popper Micromate	550962	Deve essere adescato prima dell'uso rimuovendo eventuali bolle d'aria.
Vetrino coprioggetti in vetro	Raymond Un agnello		Vetrini coprioggetti 26x76mm realizzati su ordinazione. Numero di lotto 2440980.
Guarnizione in parafilm	Azienda nazionale americana di lattine		Tagliare un pezzo di parafilm di 26x76 mm utilizzando una dima di alluminio e tagliare una fessura di 20x4 mm utilizzando un bisturi 10a. Lo spessore della guarnizione è di circa 133 μm.
Due piastre parallele in perspex	Laboratorio di tecnologia applicata Wolfson		Camera appositamente progettata composta da piastre parallele tenute insieme da 8 viti. La piastra inferiore ha una fessura di visualizzazione ritagliata al centro e un incavo poco profondo fresato per lasciare spazio per il vetrino coprioggetti, il filtro e la guarnizione. La piastra superiore in perspex ha un foro di ingresso e uscita posizionato sopra il canale di flusso.
Microvalvola elettronica a 3 vie con spazio morto minimo	Prodotti Lee Ltd.	LFYA1226032H	Collegato elettronicamente a un alimentatore a 12 volt CC.
Pompa a siringa per infusione/prelievo (PHD2000)	Apparato di Harvard	Anni 70-2001	Impostare il diametro su 29 mm e la velocità di ricarica (flusso).
Connettore a forma di L	Labhut	LE876	Da collegare alle porte di ingresso e uscita sul canale di microscorrimento Ibidi.
videocamera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Collegato a un computer che consente la registrazione di tutti i video.
Image-Pro Plus 7.0	Cibernetica dei media	Codice 41N70000-61592	Per l'analisi dei dati. Contrassegna manualmente le celle che mostrano i diversi comportamenti. Tracciare le celle per l'analisi delle velocità di rotolamento e migrazione.