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1. Induzione della senescenza da parte di farmaci chemioterapici in cellule tumorali in coltura
NOTA: Tutte le fasi di manipolazione cellulare in questa sezione devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza utilizzando pratiche sterili. Questa sezione è stata scritta per i tipi di cellule aderenti. Le celle di sospensione possono essere utilizzate con le opportune modifiche, come indicato.
- Coltivare una o più linee cellulari tumorali secondo il protocollo standard del fornitore o del laboratorio che ha fornito la/e linea/e cellulare specifica utilizzata/i.
nota: Le cellule a basso passaggio (p < 10) sono generalmente preferite in quanto vi saranno livelli più bassi di senescenza replicativa, cioè un fondo inferiore, nei campioni di cellule non trattate.
- Un giorno prima dell'induzione della senescenza da parte dei farmaci, prelevare le cellule con tripsina-EDTA 0,25% (o come raccomandato). Neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile.
nota: Questo passaggio non è necessario per le celle in sospensione.
- Contare le cellule utilizzando il metodo dell'ematocitometro standard e registrare le cellule/mL. Piastre di cellule a 1 × 103-10 × 103 cellule/cm2 in piastre di coltura in plastica standard a 6 pozzetti.
nota: La densità ottimale della placcatura dipende dal tasso di proliferazione delle cellule e deve essere determinata dall'utente. Le cellule devono essere in fase logaritmica di crescita a circa il 10%-20% di confluenza al momento del trattamento (cioè dopo 18-24 ore di incubazione dopo la piastra). La densità iniziale (cellule/mL) delle cellule in sospensione deve essere determinata dall'utente. Le piastre a sei pozzetti in genere producono un numero sufficiente di cellule senescenti per pozzetto per un campione standard di analisi di citometria a flusso. In caso di flow-sorting, è necessario utilizzare un'area superficiale molto più ampia (ad esempio, più piastre P150) per consentire il recupero di un numero sufficiente di cellule senescenti per i saggi a valle (≥1 × 106).
- Incubare le cellule piastrate per una notte (18-24 ore) in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% e un piatto di umidità.
- Trattare le cellule piastrate con farmaci chemioterapici che inducono la senescenza. Includere almeno un controllo positivo, ad esempio etoposide (ETO) o bleomicina (BLM). Preparare pozzetti duplicati per farmaco. Includi un set trattato con solo veicolo come control.
nota: L'utente deve testare una curva di dose per ciascun agente sperimentale per determinare la concentrazione ottimale per l'induzione della senescenza nella/e linea/e cellulare/i utilizzata/e.
- Incubare le cellule per 4 giorni in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% e un piatto di umidità per consentire l'inizio della senescenza. Esaminare quotidianamente i cambiamenti morfologici attesi utilizzando un microscopio ottico.
nota: Tempi di incubazione da 3 a 5 giorni possono essere accettabili a seconda del tasso di insorgenza della senescenza. I terreni possono essere cambiati e l'agente può essere riapplicato (o meno), a seconda delle esigenze, per promuovere condizioni di crescita sane ottenendo una percentuale accettabile di cellule senescenti.
- Dopo l'inizio della senescenza, raccogliere le cellule aggiungendo tripsina-EDTA 0,25% per 5 minuti a 37 °C. Quando le cellule sono dissociate in sospensione, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di terreno completo.
nota: Questo passaggio non è necessario per le cellule che crescono in sospensione. Se verrà eseguita la colorazione con marcatore di superficie, evitare l'uso di tripsina-EDTA in quanto può distruggere temporaneamente gli antigeni di superficie sulle cellule. Invece, dissociare delicatamente il monostrato utilizzando un raschietto cellulare di plastica sterile (o un reagente di dissociazione alternativo progettato per preservare gli antigeni di superficie).
- Contare le cellule in ogni campione utilizzando un ematocitometro. Calcolare le cellule/mL per ogni campione.
nota: Il blu di tripano può essere aggiunto per valutare la percentuale di cellule morte a questo punto (cioè a causa del trattamento farmacologico), ma la morte cellulare sarà determinata anche con un colorante di vitalità fluorescente durante il flusso di lavoro di colorazione DDAOG.
- Aliquotare ≥0,5 × 106 cellule per campione in provette per microcentrifuga da 1,7 mL.
nota: Il numero di cellule per campione deve essere standardizzato per tutti i campioni.
- Centrifugare le provette per 5 minuti a 1.000 × g in una microcentrifuga a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
nota: Se non è disponibile una microcentrifuga refrigerata, può essere accettabile eseguire centrifugazioni a temperatura ambiente per alcuni tipi di celle resilienti.
- Procedere alla colorazione DDAOG nella sezione 2.
2. Colorazione DDAOG di SA-β-Gal in campioni cellulari
- Diluire 1 mM di Bafilomicina A1 a 1:1.000x in terreno DMEM (senza FBS) per una concentrazione finale di 1 μM.
- Aggiungere la soluzione preparata di Baf-DMEM ai campioni di pellet cellulare (dal punto 1.11) per una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL.
nota: Ad esempio, se si utilizzano 0,5 × 106 cellule per campione, aggiungere 0,5 ml di Baf-DMEM.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C (senza CO2) su un rotatore/agitatore impostato a bassa velocità.
nota: Evitare gli incubatori di CO2 per il processo di colorazione, che possono acidificare le soluzioni e quindi interferire con la colorazione Baf e DDAOG.
- Senza lavaggio, aggiungere la soluzione madre DDAOG (5 mg/mL) a 1:500x (10 μg/mL finale) a ciascun campione. Pipetta per mescolare. Riposizionare su un rotatore/agitatore a 37 °C (senza CO2) per 60 min. Proteggere dalla luce diretta.
- Centrifugare le provette per 5 minuti a 1.000 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
- Lavare con 1 mL di BSA ghiacciato allo 0,5% per provetta e pipettare per mescolare. Centrifugare le provette per 5 minuti a 1.000 x g a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte per lavare accuratamente le celle. Rimuovere il surnatante e procedere.
nota: È importante eseguire le fasi di lavaggio del passaggio 2.6 per rimuovere il DDAOG non scisso, che può presentare un'emissione di fluorescenza indesiderata (460/610 nm).
- (Opzionale) Fissazione e conservazione delle cellule colorate con DDAOG per analisi successive
- Aggiungere 0,5 mL di paraformaldeide ghiacciata al 4% goccia per goccia a ciascun campione lavato. Pipetta per mescolare.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule 2 volte con 1 mL di PBS.
- Conservare i campioni per un massimo di 1 settimana a 4 °C prima dell'analisi con citometria a flusso.
nota: Per i campioni fissi, saltare il passaggio 2.8.
- Diluire il materiale Calcein Violet 450 AM (1 mM) a 1:1.000x in 1% BSA-PBS (1 μM finale). Aggiungere 300 μl (per i campioni di cellule in coltura) ai pellet cellulari lavati dal passaggio 2.6. Incubare per 15 minuti su ghiaccio al buio.
- Procedere con l'impostazione della citometria a flusso (sezione 3).
3. Configurazione del citometro a flusso e acquisizione dati
- Trasferire i campioni cellulari in provette compatibili con lo strumento di citometria a flusso. Metti i tubi sul ghiaccio e tienili al riparo dalla luce.
nota: Se si osservano aggregati nelle sospensioni cellulari, far passare la sospensione attraverso filtri cellulari da 70-100 μm prima dell'analisi. Non utilizzare filtri da 40 μm perché possono escludere alcune delle celle senescenti più grandi.
- Nel software di riferimento (vedere la Tabella dei materiali), aprire i seguenti grafici: 1) grafico a punti FSC-A vs SSC-A, 2) istogramma del canale viola, 3) diagramma a punti del canale rosso lontano (ad es. APC-A) rispetto al canale verde (ad es. FITC-A).
nota: È possibile utilizzare anche grafici di esclusione doppietti e istogrammi a canale singolo, ma non sono strettamente necessari.
- Avviare l'acquisizione dei dati del citometro.
- Posizionare il campione di controllo solo per il veicolo macchiato con DDAOG sulla porta di aspirazione. A bassa velocità di aspirazione, iniziare ad acquisire i dati del campione.
- Regolare le tensioni FSC e SSC in modo che il >90% degli eventi sia contenuto all'interno del grafico. Se le celle non si adattano bene al grafico, ridurre l'impostazione di ridimensionamento dell'area a 0,33-0,5 unità.
- Rimuovere il campione solo veicolo senza registrare i dati.
- (Facoltativo) Aggiungere una goccia di microsfere di calibrazione arcobaleno a una provetta citometrica con 1 mL di PBS. Posizionare il tubo sulla porta di aspirazione del citometro. Iniziare ad acquisire dati campione.
- Regolare le tensioni dei canali viola, verde e rosso lontano in modo che il picco superiore della microsfera arcobaleno sia compreso tra 104 e 105 unità di fluorescenza relativa in ciascun canale e che tutti i picchi siano ben separati in ciascun canale. Registra 10.000 eventi. Rimuovere il tubo.
- Posizionare il campione di controllo positivo (ad es. BLM, ETO) colorato con DDAOG sulla porta di aspirazione. A bassa velocità, acquisire dati di esempio. Osserva gli eventi nei canali FSC, SSC, viola, verde e rosso lontano per assicurarti che oltre il 90% degli eventi sia contenuto all'interno di tutti i grafici. Cerca un aumento del segnale AF e DDAOG rispetto al controllo solo del veicolo.
- Se si utilizza un citometro di smistamento, avviare lo smistamento in questo passaggio.
- Ai fini della registrazione, registrare 10.000 celle per il campione di controllo e per ciascun campione selezionato.
- Smistare la quantità desiderata di cellule (≥1 × 106 è tipicamente adatta) in una provetta di raccolta adatta allo strumento con 3-5 mL di terreno di coltura.
- Dopo l'ordinamento, procedere alla coltura o all'analisi a valle.
nota: Per il citometro a flusso calibrato qui utilizzato, le tensioni ottimali del canale sono tipicamente comprese tra 250 e 600 (gamma media), ma le tensioni ottimali e gli intervalli di tensione del canale variano a seconda dello strumento. Evitare l'uso di tensioni a intervalli molto bassi o alti, che potrebbero sopprimere il segnale o amplificare il rumore.
- Dopo aver completato i passaggi 3.1-3.5 e aver apportato le modifiche necessarie alle impostazioni del citometro, registrare i dati per tutti i campioni. Assicurarsi che le impostazioni rimangano uniformi per tutte le registrazioni di esempio. Registra ≥10.000 eventi per campione di cellule in coltura.
nota: Sebbene il gating e l'analisi possano essere eseguiti utilizzando un software di acquisizione dati (ad esempio, FACSDiva), un flusso di lavoro completo di gating e analisi da condurre dopo l'acquisizione utilizzando un software di analisi separato (FlowJo) è descritto nella sezione 4 di seguito. L'analisi post-acquisizione è preferita per ridurre i tempi di permanenza presso la postazione di lavoro del citometro e sfruttare gli strumenti aggiuntivi inclusi nel software di analisi dedicato.
- Salvare i dati di esempio in formato file .fcs. Esporta i file su una workstation dotata di software di analisi della citometria a flusso (ad es. FlowJo).
4. Analisi dei dati di citometria a flusso
NOTA: Il flusso di lavoro presentato utilizza il software FlowJo. È possibile utilizzare un software alternativo di analisi dei dati di citometria a flusso se i passaggi chiave descritti in questa sezione vengono seguiti in modo simile.
- Utilizzando il software FlowJo, apri i file di dati .fcs dal passaggio 3.7.
- Aprire la finestra del layout.
- Trascina e rilascia tutti i campioni nella finestra del layout.
- Celle vitali del cancello.
- Fare doppio clic sui dati di esempio per il controllo solo veicolo per aprire la finestra dei dati.
- Visualizza i dati come un istogramma del canale viola. Identificare le cellule vitali colorate da CV450 in base alla loro fluorescenza più brillante rispetto alle cellule morte.
- Disegna un gate utilizzando lo strumento istogramma a gate singolo per includere solo le celle vitali. Assegna un nome al cancello praticabile.
- Quindi, dalla finestra del layout di esempio, trascinare il gate valido sugli altri campioni di celle per applicare il gate in modo uniforme.
- Nella finestra di layout, visualizzare tutti i campioni come istogrammi del canale viola (vitalità). Verificare che il gating cellulare vitale sia appropriato per tutti i campioni prima di procedere; In caso contrario, apportare le modifiche necessarie.
nota: La colorazione di vitalità può presentare variazioni tra i trattamenti.
- Celle senescenti a cancello.
- Fare doppio clic sui dati della cella valida con gate per il controllo solo veicolo per aprire la finestra dei dati.
- Visualizza i dati come un grafico a punti per il canale rosso lontano (DDAOG) rispetto al canale verde (AF).
- Disegna un cancello utilizzando lo strumento di controllo rettangolare per includere il <5% delle celle DDAOG+ e AF+ (quadrante in alto a destra). Nomina il cancello senescente.
- Quindi, dalla finestra del layout di esempio, trascinare il gate senescente sui sottoinsiemi vitali degli altri campioni di celle per applicare il gate in modo uniforme.
- Nella finestra di layout, trascinare e rilasciare tutti i sottoinsiemi di celle validi controllati nella sezione 4.4. Visualizza tutti i campioni vitali come grafici a punti rossi lontani (ad esempio, APC-A) rispetto a quelli del canale verde (ad esempio, FITC-A).
- Assicurarsi che il cancello senescente disegnato al punto 4.5.3 sia visibile su tutti i lotti e che il cancello per il controllo del solo veicolo presenti celle senescenti ≤5%-10%.
- Una volta determinata la percentuale di cellule senescenti utilizzando i passaggi precedenti, presentare i dati risultanti utilizzando i grafici FlowJo, riassunti in una tabella di dati e/o analizzati statisticamente utilizzando un software standard.